Wpływ ekstraktu Allium Sativum i Moringa Oleifera na szkliwo zębów

To badanie eksperymentalne na zwierzętach zostanie przeprowadzone w Animal House, University of Health Sciences, Lahore (UHS) i COMSATS University, Lahore. Do tego badania zostanie wziętych pięćdziesiąt cztery zdrowe, samce, białe króliki nowozelandzkie (w wieku od 9 do 10 tygodni). Króliki zostaną losowo podzielone na 6 grup. Wielkość próby będzie wynosić 9 królików w każdej grupie. Zwierzętom doświadczalnym zostaną przypisane numery 1,2,3,4, do 54 za pomocą generatora liczb losowych i losowo podzielone na sześć grup (n=9) i zostaną przypisane do grupy A, B, C, D, E i F. Zdrowe samce, białe króliki nowozelandzkie o wadze 1000-1200 gramów (wiek 9-10 tygodni) zostaną wybrane z University of Veterinary and Animal Sciences, Lahore. Zwierzęta zostaną przeniesione do zwierzątiarni UHS. Zwierzęta będą trzymane w eksperymentalnym laboratorium badawczym w kontrolowanej temperaturze pokojowej (22-24°C) i wilgotności (45-65%) w cyklu 12/12 godzin naturalnego światła i ciemności przez 2 tygodnie w celu aklimatyzacji w nowym środowisku. Wszystkie zwierzęta doświadczalne będą karmione warzywami, owocami i wodą destylowaną ad libitum. Pod koniec 12 tygodnia wszystkie zwierzęta zostaną uśmiercone w głębokim znieczuleniu. Chlorowodorek ketaminy 45 mg/kg m.c. i ksylazyna 5 mg/kg m.c. podawane I/M w celu podtrzymania głębokiego znieczulenia. Następnie wstrzyknięto 20 mg ksylazyny do żyły małżowiny usznej w celu uśmiercenia królików, podczas gdy były one znieczulone.(35).

Pobieranie krwi: Tętnica ucha środkowego(36) lub żyła odpiszczelowa boczna zostaną wybrane do pobrania 4 ml krwi w dniu 0, po 8 tygodniach i pod koniec 12 tygodni. Próbka zostanie pobrana do probówki do oddzielania surowicy do badań, takich jak morfologia krwi, fosfataza alkaliczna, poziom wapnia i fosforanów.

Technika pobierania próbek tkanek:

Do badań zostanie pobrany fragment 4x5 mm2 ze środkowej jednej trzeciej powierzchni korony wargowej. Cięcie zostanie wykonane za pomocą tarczy diamentowej i wysokoobrotowej turbiny z irygacją wody w celu uniknięcia przegrzania próbki. Prawe siekacze żuchwy wszystkich królików zostaną wybrane do SEM i AFM. Lewe siekacze żuchwy wszystkich królików zostaną poddane analizie SEM-EDX i RMS. Wszystkie próbki zostaną oznakowane i przechowywane w wysterylizowanym pojemniku zawierającym 12% formalinę przez 72 godziny.

Przetwarzanie laboratoryjne:

1. Skaningowa mikroskopia elektronowa: Prawy siekacz żuchwy zostanie wybrany do analizy SEM. Strukturę i cechy morfologiczne szkliwa będzie można zobaczyć na jego obrazach. Próbka zostanie przemyta wodą destylowaną i osuszona dmuchawą gorącego powietrza z małą prędkością. Jednorazowo na próbce można utrwalić szesnaście próbek. Próbki zostaną przymocowane do pchnięcia podwójną taśmą miedzianą. Odsłonięte dźgnięcie zostanie również zakryte taśmą miedzianą i tylko część próbki pozostanie odkryta.

   Złota powłoka zostanie wykonana w maszynie do napylania katodowego, aby utworzyć przewodnik powierzchniowy dla drobnych szczegółów obrazów. Próbka zostanie umieszczona w komorze maszyny do napylania katodowego, a pokrywa zostanie zamknięta. Wewnątrz komory powstanie próżnia i wypełni się argonem. Dany będzie potencjał 40 woltów. Dzięki temu w komorze powstanie plazma, a elektrony gazu argonowego uderzą w złotą płytkę. Drobne cząstki złota zaczną rozpylać się na dźgnięciu próbki. Po wykonaniu złotej powłoki procedura zostanie odwrócona. Komora zostanie wypełniona powietrzem, a pokrywa zostanie otwarta. Teraz próbka zostanie przetworzona w NOVA NANOSEM 450 w celu uzyskania szczegółów ultrastrukturalnych.

2. Energetyczna spektroskopia dyspersyjna: EDX zostanie wykorzystany do badania składu pierwiastkowego składników mineralnych. Detektor OXFORD X-ACT, PENTA FET będzie połączony z NOVA NANOSEM 450. Ta sama próbka użyta do SEM będzie również użyta do analizy SEM-EDX. To da szczegóły na powierzchni do grubości 2 mikronów.

3. Mikroskop sił atomowych: AFM (SPM-9500J3, Shimadzu Corp, Japonia) posłuży do oceny cech morfologicznych powierzchni szkliwa. Zapewnia trójwymiarową topografię powierzchni bez przygotowania próbki. Ten mikroskop jest przeznaczony do skanowania próbki za pomocą sondy. Próbka zostanie przymocowana do króćca, który zostanie naprawiony i ręcznie wyregulowany. Regulacja lasera zostanie przeprowadzona po określeniu częstotliwości sondy. Na koniec skanowanie i obróbka obrazu zostaną wykonane za pomocą przetwarzania systemu WinSPM. Dla jednej reprezentatywnej próbki zostaną wykonane mikrografie w sześciu różnych obszarach (obszar skanowania 2,0 × 2,0 μm) przy użyciu oprogramowania AFM (SPM-9500J3, Shimadzu Corp, Japonia) i oprogramowania AFM (SPM-Offline, Shimadzu Corp, Japonia).

   AFM tworzy obrazy 3D powierzchni, skanując wzdłuż powierzchni wspornik wielkości mikrona, który jest zwykle wykonany z krzemu lub azotku krzemu, z końcówką o promieniu krzywizny ~ 10 nm. Wspornik jest odchylany przez siły między końcówką a powierzchnią, które wynoszą ~nN i obejmują udział sił elektrostatycznych, sił solwatacji, oddziaływań Vandera Waalsa i wiązań chemicznych. To ugięcie wspornika jest mierzone przez plamkę lasera odbijającą się od górnej powierzchni wspornika w układzie fotodiod, które dostarczają obrazy do komputera.

4. Spektroskopia Ramana: Jest to nieniszcząca technika analizy chemicznej, która dostarcza szczegółowych informacji na temat struktury chemicznej, krystaliczności i oddziaływań molekularnych. RMS poda nam szczegóły całej grubości szkliwa na temat składu cząsteczkowego i jego interakcji z próbką. Do tej analizy nie jest wymagane żadne specjalne przygotowanie próbki, a próbkę można również wykorzystać do innych badań. Do tego badania zostanie użyty mikroskop ramanowski InVia firmy RENISHAW UK. Intensywność lasera 488 nm będzie używana przez 10 sekund. RMS zostanie wykonany w 6 różnych miejscach, a średni odczyt zostanie wykorzystany w badaniu.