Effetti dell'estratto di Allium Sativum e Moringa Oleifera sullo smalto dei denti

Questo studio sperimentale sugli animali sarà condotto presso Animal House, University of Health Sciences, Lahore (UHS) e COMSATS University, Lahore. Per questo studio saranno presi per lo studio cinquantaquattro conigli maschi bianchi sani della Nuova Zelanda (da 9 a 10 settimane). I conigli saranno divisi casualmente in 6 gruppi. La dimensione del campione sarà di 9 conigli in ciascun gruppo. Agli animali da esperimento verrà assegnato il numero 1,2,3,4, fino a 54 utilizzando il generatore di numeri casuali e verranno divisi casualmente in sei gruppi (n=9) e verranno assegnati come gruppo A, B, C, D, E e F. Conigli maschi sani, bianchi della Nuova Zelanda del peso di 1000-1200 grammi (età 9-10 settimane) saranno selezionati dall'Università di Scienze Veterinarie e Animali, Lahore. Gli animali saranno trasferiti nella stalla dell'UHS. Gli animali saranno tenuti nel laboratorio di ricerca sperimentale a temperatura ambiente controllata (22-24°C) e umidità (45-65%) in un ciclo di luce e buio naturale di 12/12 ore per 2 settimane per acclimatarsi nel nuovo ambiente. Tutti gli animali da esperimento saranno nutriti con verdure, frutta e acqua distillata ad libitum. Al termine delle 12 settimane, tutti gli animali saranno sacrificati in anestesia profonda. Verranno somministrati ketamina cloridrato 45 mg/kg p.v. e xilazina 5 mg/kg p.v. I/M per mantenere l'anestesia profonda. Successivamente, 20 mg di xilazina sono stati iniettati nella vena del padiglione auricolare per sacrificare i conigli mentre erano anestetizzati.(35).

Prelievo di sangue: verrà selezionata l'arteria auricolare centrale (36) o la vena safena laterale per raccogliere 4 ml di sangue il giorno 0, dopo 8 settimane e alla fine delle 12 settimane. Il campione verrà raccolto in una provetta di separazione del siero per indagini come il conteggio del piombo nel sangue, la fosfatasi alcalina, il livello di calcio e fosfato.

Tecnica di campionamento dei tessuti:

Verrà prelevata per le indagini una porzione di 4x5 mm2 dal terzo medio della superficie labiale della corona. Il taglio sarà effettuato mediante disco diamantato e turbina ad alta velocità con irrigazione di acqua all'ovoide per riscaldamento del campione. Gli incisivi mandibolari destri di tutti i conigli saranno selezionati per SEM e AFM. Gli incisivi mandibolari sinistri di tutti i conigli saranno selezionati mediante analisi SEM-EDX e RMS. Tutti i campioni saranno etichettati e conservati in un contenitore sterilizzato contenente il 12% di formalina per 72 ore.

Lavorazione in laboratorio:

1. Microscopia elettronica a scansione: verrà selezionato l'incisivo mandibolare destro per l'analisi SEM. La struttura e le caratteristiche morfologiche dello smalto saranno viste dalle sue immagini. Il campione verrà lavato con acqua distillata e asciugato mediante soffiante ad aria calda a bassa velocità. Sedici campioni possono essere fissati su un campione alla volta. I campioni verranno fissati su pugnalata mediante doppio nastro di rame. Anche la pugnalata esposta sarà coperta da nastro di rame e solo la parte del campione sarà lasciata scoperta.

   Il rivestimento in oro verrà eseguito in una macchina per verniciatura a spruzzo per creare il conduttore di superficie per i dettagli fini delle immagini. La pugnalata del campione verrà posizionata nella camera della macchina sputter e il coperchio verrà chiuso. All'interno della camera si creerà il vuoto e si riempirà di gas argon. Verrà fornito un potenziale di 40 volt. Da questo plasma si formerà all'interno della camera e gli elettroni del gas argon colpiranno la lamina d'oro. Le minuscole particelle d'oro inizieranno a sputacchiare sulla pugnalata del campione. Una volta effettuato il rivestimento in oro, la procedura sarà invertita. La camera sarà riempita d'aria e il coperchio sarà aperto. Ora il campione verrà processato in NOVA NANOSEM 450 per i dettagli ultrastrutturali.

2. Spettroscopia a dispersione di energia: EDX sarà utilizzato per studiare la composizione elementare dei contenuti minerali. Un rilevatore di OXFORD X-ACT, PENTA FET sarà collegato con NOVA NANOSEM 450. Lo stesso campione utilizzato per SEM verrà utilizzato anche per l'analisi SEM-EDX. Questo darà dettagli sulla superficie fino a 2 micron di spessore.

3. Microscopio a forza atomica: AFM (SPM-9500J3, Shimadzu Corp, Giappone) sarà utilizzato per la valutazione delle caratteristiche morfologiche della superficie dello smalto. Fornisce la topografia superficiale tridimensionale senza alcuna preparazione del campione. Questa microscopia è progettata per scansionare il campione con una sonda. Il campione sarà attaccato allo stub, che sarà fissato e regolato manualmente. La regolazione del laser verrà eseguita dopo aver determinato la frequenza della sonda. Infine, la scansione e l'elaborazione delle immagini verranno eseguite con l'elaborazione del sistema WinSPM. Per un campione rappresentativo, verranno eseguite micrografie in sei diverse aree (area di scansione 2,0 × 2,0 μm) utilizzando AFM (SPM-9500J3, Shimadzu Corp, Giappone) e software AFM (SPM-Offline, Shimadzu Corp, Giappone).

   AFM crea immagini 3D di una superficie scansionando un cantilever di dimensioni micron sulla superficie, che è tipicamente costituito da silicio o nitruro di silicio, con una punta il cui raggio di curvatura è di ~ 10 nm. Il cantilever è deviato dalle forze tra la punta e la superficie, che sono ~nN e includono contributi di forze elettrostatiche, forze di solvatazione, interazioni di Vander Waals e legame chimico. Questa deflessione del cantilever è misurata da un punto laser che si riflette dalla superficie superiore del cantilever in una serie di fotodiodi, che fornisce immagini sul computer.

4. Spettroscopia Raman: è una tecnica di analisi chimica non distruttiva che fornisce informazioni dettagliate sulla struttura chimica, la cristallinità e le interazioni molecolari. L'RMS ci fornirà i dettagli dell'intero spessore dello smalto sulla composizione molecolare e la sua interazione del campione. Non sarà necessaria alcuna preparazione speciale del campione per questa analisi e il campione può essere utilizzato anche per altre indagini. Per questo studio verrà utilizzato il microscopio InVia Raman di RENISHAW UK. L'intensità del laser 488nm verrà utilizzata per 10 secondi. L'RMS verrà eseguito su 6 punti diversi e la lettura media verrà utilizzata nello studio.