Efectos del extracto de Allium Sativum y Moringa Oleifera sobre el esmalte dental

Este estudio experimental con animales se llevará a cabo en Animal House, University of Health Sciences, Lahore (UHS) y COMSATS University, Lahore. Para este estudio, se tomarán cincuenta y cuatro conejos NewZeeland blancos, machos y sanos (de 9 a 10 semanas) para el estudio. Los conejos se dividirán aleatoriamente en 6 grupos. El tamaño de la muestra será de 9 conejos en cada grupo. A los animales de experimentación se les asignará el número 1,2,3,4, hasta el 54 utilizando el generador de números aleatorios y se dividirán aleatoriamente en seis grupos (n=9) y se asignarán como grupo A, B, C, D, E y F. Se seleccionarán conejos de Nueva Zelanda machos, blancos y sanos que pesan 1000-1200 gramos (Edad 9-10 semanas) de la Universidad de Ciencias Veterinarias y Animales, Lahore. Los animales serán trasladados a la casa de animales de UHS. Los animales se mantendrán en un laboratorio de investigación experimental a temperatura ambiente controlada (22-24 °C) y humedad (45-65 %) bajo un ciclo de luz natural y oscuridad de 12/12 horas durante 2 semanas para aclimatarse en el nuevo entorno. Todos los animales de experimentación serán alimentados con verduras, frutas y agua destilada ad libitum. Al final de las 12 semanas, todos los animales serán sacrificados bajo anestesia profunda. Se administrará clorhidrato de ketamina 45 mg/kg p.v. y xilazina 5 mg/kg p.v. I/M para mantener la anestesia profunda. Posteriormente, se inyectaron 20 mg de xilazina en la vena del pabellón auricular para sacrificar a los conejos mientras estaban anestesiados.(35).

Muestreo de sangre: se seleccionará la arteria auricular central (36) o la vena safena lateral para recolectar 4 ml de sangre el día 0, después de 8 semanas y al final de las 12 semanas. La muestra se recolectará en un tubo de separación de suero para investigaciones como el recuento de plomo en sangre, la fosfatasa alcalina, el calcio y el nivel de fosfato.

Técnica de muestreo de tejido:

Se tomará una porción de 4x5 mm2 del tercio medio de la superficie labial de la corona para investigaciones. El corte se realizará mediante disco de diamante y turbina de alta velocidad con riego de agua al ovoide sobre calentamiento de muestra. Se seleccionarán los incisivos mandibulares derechos de todos los conejos para SEM y AFM. Se seleccionarán los incisivos mandibulares izquierdos de todos los conejos mediante análisis SEM-EDX y RMS. Todas las muestras se etiquetarán y almacenarán en un recipiente esterilizado con formalina al 12 % durante 72 horas.

Procesamiento de laboratorio:

1. Microscopía electrónica de barrido: se seleccionará el incisivo mandibular derecho para el análisis SEM. La estructura y las características morfológicas del esmalte se verán en sus imágenes. La muestra se lavará con agua destilada y se secará con un soplador de aire caliente a baja velocidad. Se pueden fijar dieciséis muestras en una punzada de muestra a la vez. Las muestras se fijarán a puñaladas mediante doble cinta de cobre. La punción expuesta también se cubrirá con cinta de cobre y solo se dejará descubierta la parte de la muestra.

   El recubrimiento de oro se realizará en una máquina de recubrimiento por pulverización catódica para hacer que el conductor de la superficie obtenga detalles finos de las imágenes. La punción de la muestra se colocará en la cámara de la máquina de pulverización catódica y la tapa se cerrará. Dentro de la cámara, se creará vacío y se llenará de gas argón. Se dará un potencial de 40 voltios. Por este plasma se formará dentro de la cámara y los electrones del gas argón chocarán contra la placa de oro. Las diminutas partículas de oro comenzarán a chisporrotear en la punción de la muestra. Una vez realizado el recubrimiento de oro, se invertirá el procedimiento. La cámara se llenará de aire y se abrirá la tapa. Ahora la muestra será procesada en NOVA NANOSEM 450 para detalles ultraestructurales.

2. Espectroscopia de dispersión de energía: EDX se utilizará para estudiar la composición elemental de los contenidos minerales. Se adjuntará un detector de OXFORD X-ACT, PENTA FET con NOVA NANOSEM 450. La misma muestra utilizada para SEM también se utilizará para el análisis SEM-EDX. Esto dará detalles en la superficie de hasta 2 micras de espesor.

3. Microscopio de fuerza atómica: AFM (SPM-9500J3, Shimadzu Corp, Japón) se utilizará para evaluar las características morfológicas de la superficie del esmalte. Proporciona la topografía de la superficie tridimensional sin ninguna preparación de la muestra. Esta microscopía está diseñada para escanear la muestra con una sonda. La muestra se adjuntará en el talón, que será fijo y ajustado manualmente. El ajuste del láser se realizará después de determinar la frecuencia de la sonda. Finalmente, el escaneo y procesamiento de imágenes se realizará con el sistema de procesamiento WinSPM. Para una muestra representativa, se tomarán micrografías en seis áreas diferentes (área de escaneo de 2,0 × 2,0 μm) utilizando AFM (SPM-9500J3, Shimadzu Corp, Japón) y el software AFM (SPM-Offline, Shimadzu Corp, Japón).

   AFM crea imágenes 3D de una superficie al escanear un voladizo de tamaño micrométrico a lo largo de la superficie, que generalmente está hecho de silicio o nitruro de silicio, con una punta cuyo radio de curvatura es de ~10 nm. El voladizo es desviado por las fuerzas entre la punta y la superficie, que son ~nN e incluyen contribuciones de fuerzas electrostáticas, fuerzas de solvatación, interacciones de Vander Waals y enlaces químicos. Esta desviación del voladizo se mide mediante un punto láser que se refleja desde la superficie superior del voladizo hacia una matriz de fotodiodos, que proporciona imágenes en la computadora.

4. Espectroscopia Raman: Es una técnica de análisis químico no destructivo que proporciona información detallada sobre la estructura química, la cristalinidad y las interacciones moleculares. El RMS nos dará los detalles de todo el espesor del esmalte sobre la composición molecular y su interacción de la muestra. No se necesitará una preparación especial de la muestra para este análisis y la muestra también se puede utilizar para otras investigaciones. Para este estudio se utilizará el microscopio InVia Raman de RENISHAW UK. La intensidad del láser 488nm se utilizará durante 10 segundos. El RMS se realizará en 6 puntos diferentes y la lectura promedio se usará en el estudio.