Auswirkungen von Allium Sativum und Moringa Oleifera-Extrakt auf den Zahnschmelz

Diese tierexperimentelle Studie wird in Animal House, University of Health Sciences, Lahore (UHS) und COMSATS University, Lahore, durchgeführt. Für diese Studie werden 54 gesunde, männliche, weiße Neuseeland-Kaninchen (9 bis 10 Wochen) für die Studie genommen. Kaninchen werden nach dem Zufallsprinzip in 6 Gruppen eingeteilt. Die Stichprobengröße beträgt 9 Kaninchen in jeder Gruppe. Den Versuchstieren werden die Nummern 1, 2, 3, 4 bis 54 unter Verwendung des Zufallszahlengenerators zugewiesen und sie werden nach dem Zufallsprinzip in sechs Gruppen (n = 9) aufgeteilt und den Gruppen A, B, C, D, E und zugeordnet F. Gesunde männliche, weiße Neuseeland-Kaninchen mit einem Gewicht von 1000–1200 Gramm (Alter 9–10 Wochen) werden von der University of Veterinary and Animal Sciences, Lahore, ausgewählt. Die Tiere werden ins Tierhaus der UHS verlegt. Die Tiere werden in einem experimentellen Forschungslabor bei kontrollierter Raumtemperatur (22–24 °C) und Luftfeuchtigkeit (45–65 %) unter 12/12 Stunden natürlichem Licht- und Dunkelzyklus für 2 Wochen gehalten, um sich an die neue Umgebung zu akklimatisieren. Alle Versuchstiere werden ad libitum mit Gemüse, Obst und destilliertem Wasser gefüttert. Am Ende der 12 Wochen werden alle Tiere unter tiefer Anästhesie getötet. Ketaminhydrochlorid 45 mg/kg KG und Xylazin 5 mg/kg KG I/M werden gegeben, um eine tiefe Anästhesie aufrechtzuerhalten. Danach wurden 20 mg Xylazin in die Ohrmuschelvene injiziert, um die Kaninchen zu töten, während sie anästhesiert waren (35).

Blutentnahme: Am Tag 0, nach 8 Wochen und am Ende von 12 Wochen werden die A. auricularis centralis (36) oder die V. saphena lateralis ausgewählt, um 4 ml Blut zu entnehmen. Die Probe wird in Serumtrennröhrchen für Untersuchungen wie Blutbleizahl, alkalische Phosphatase, Kalzium- und Phosphatspiegel gesammelt.

Technik der Gewebeentnahme:

Ein Teil von 4 x 5 mm2 aus dem mittleren Drittel der Kronenlabialfläche wird für Untersuchungen entnommen. Das Schneiden erfolgt mit einer Diamantscheibe und einer Hochgeschwindigkeitsturbine mit Wasserspülung, um eine Überhitzung der Probe zu vermeiden. Die rechten unteren Schneidezähne aller Kaninchen werden für SEM und AFM ausgewählt. Die linken unteren Schneidezähne aller Kaninchen werden einer SEM-EDX- und RMS-Analyse unterzogen. Alle Proben werden etikettiert und in einem sterilisierten Behälter mit 12 % Formalin für 72 Stunden gelagert.

Laborverarbeitung:

1. Rasterelektronenmikroskopie: Der rechte untere Schneidezahn wird für die SEM-Analyse ausgewählt. Die Struktur und morphologischen Merkmale des Zahnschmelzes werden anhand seiner Bilder sichtbar. Die Probe wird mit destilliertem Wasser gewaschen und mit einem Heißluftgebläse bei langsamer Geschwindigkeit getrocknet. Sechzehn Proben können gleichzeitig auf einem Probenstab fixiert werden. Die Proben werden mit doppeltem Kupferband auf dem Stab fixiert. Der freigelegte Stich wird ebenfalls mit Kupferband abgedeckt und nur der Probenteil wird unbedeckt gelassen.

   Die Goldbeschichtung erfolgt in einer Sputter-Coater-Maschine, um den Oberflächenleiter für feine Bilddetails herzustellen. Der Probenstab wird in die Sputtermaschinenkammer gelegt und der Deckel wird geschlossen. In der Kammer wird ein Vakuum erzeugt und Argongas eingefüllt. Es wird ein Potential von 40 Volt gegeben. Dadurch wird Plasma in der Kammer gebildet und die Elektronen des Argongases treffen auf die Goldplatte. Die winzigen Goldpartikel beginnen auf dem Probenstab zu spritzen. Sobald die Goldbeschichtung abgeschlossen ist, wird der Vorgang umgekehrt. Die Kammer wird mit Luft gefüllt und der Deckel geöffnet. Jetzt wird die Probe in NOVA NANOSEM 450 für ultrastrukturelle Details verarbeitet.

2. Energiedispersive Spektroskopie: EDX wird verwendet, um die elementare Zusammensetzung von Mineralinhaltsstoffen zu untersuchen. Ein Detektor von OXFORD X-ACT, PENTA FET wird mit NOVA NANOSEM 450 verbunden. Dieselbe Probe, die für SEM verwendet wird, wird auch für die SEM-EDX-Analyse verwendet. Dadurch werden Details auf der Oberfläche bis zu einer Dicke von 2 Mikron angezeigt.

3. Rasterkraftmikroskop: AFM (SPM-9500J3, Shimadzu Corp, Japan) wird für die Bewertung der morphologischen Merkmale der Schmelzoberfläche verwendet. Es liefert die dreidimensionale Oberflächentopographie ohne jegliche Probenvorbereitung. Diese Mikroskopie dient zum Scannen der Probe mit einer Sonde. Die Probe wird auf einem Stummel befestigt, der fixiert und manuell angepasst wird. Die Laserjustierung erfolgt nach der Bestimmung der Sondenfrequenz. Schließlich werden das Scannen und die Bildverarbeitung mit der WinSPM-Systemverarbeitung durchgeführt. Für eine repräsentative Probe werden mit AFM (SPM-9500J3, Shimadzu Corp, Japan) und AFM-Software (SPM-Offline, Shimadzu Corp, Japan) Mikroaufnahmen an sechs verschiedenen Bereichen (2,0 × 2,0 μm Scanbereich) aufgenommen.

   AFM erstellt 3D-Bilder einer Oberfläche, indem ein Ausleger in Mikrometergröße über die Oberfläche geführt wird, die typischerweise aus Silizium oder Siliziumnitrid besteht, mit einer Spitze, deren Krümmungsradius ~10 nm beträgt. Der Cantilever wird durch die Kräfte zwischen der Spitze und der Oberfläche abgelenkt, die ~nN betragen und Beiträge von elektrostatischen Kräften, Solvatationskräften, Vander-Waals-Wechselwirkungen und chemischen Bindungen beinhalten. Diese Auslenkung des Cantilevers wird durch einen Laserpunkt gemessen, der von der oberen Oberfläche des Cantilevers in eine Anordnung von Fotodioden reflektiert wird, die Bilder auf dem Computer liefert.

4. Raman-Spektroskopie: Es handelt sich um eine zerstörungsfreie chemische Analysetechnik, die detaillierte Informationen über chemische Struktur, Kristallinität und molekulare Wechselwirkungen liefert. Das RMS gibt uns Auskunft über die gesamte Schmelzdicke, über die molekulare Zusammensetzung und deren Wechselwirkung mit der Probe. Für diese Analyse ist keine spezielle Probenvorbereitung erforderlich und die Probe kann auch für andere Untersuchungen verwendet werden. Für diese Studie wird das InVia-Raman-Mikroskop von RENISHAW UK verwendet. Die Laserintensität 488 nm wird für 10 Sekunden verwendet. Der RMS wird an 6 verschiedenen Stellen durchgeführt und der Durchschnittswert wird in der Studie verwendet.