Allium Sativum ja Moringa Oleifera -uutteen vaikutukset hammaskiilteeseen

Tämä eläinkokeellinen tutkimus suoritetaan Eläintalossa, Terveystieteiden yliopistossa Lahoressa (UHS) ja COMSATS Universityssä Lahoressa. Tätä tutkimusta varten tutkimukseen otetaan viisikymmentäneljä tervettä urospuolista, valkoista uusiseelantilaista kania (9-10 viikkoa). Kanit jaetaan satunnaisesti 6 ryhmään. Näytteen koko on 9 kania kussakin ryhmässä. Koe-eläimet jaetaan satunnaislukugeneraattorin avulla numeroihin 1, 2, 3, 4, 54 asti ja jaetaan satunnaisesti kuuteen ryhmään (n=9) ja ne jaetaan ryhmiin A, B, C, D, E ja F. Terveet urospuoliset, valkoiset uusiseelantilaiset kanit, jotka painavat 1000-1200 grammaa (ikä 9-10 viikkoa), valitaan University of Veterinary and Animal Sciences, Lahore. Eläimet siirretään UHS:n eläintaloon. Eläimiä pidetään kokeellisessa tutkimuslaboratoriossa kontrolloidussa huoneenlämpötilassa (22-24°C) ja kosteudessa (45-65 %) 12/12 tunnin luonnonvalon ja pimeyden syklissä 2 viikon ajan sopeutumaan uuteen ympäristöön. Kaikki koe-eläimet ruokitaan vihanneksilla, hedelmillä ja tislatulla vedellä ad libitum. 12 viikon lopussa kaikki eläimet lopetetaan syväanestesiassa. Ketamiinihydrokloridia 45 mg/kg b.w ja ksylatsiinia 5 mg/kg k.w I/M annetaan syvän anestesian ylläpitämiseksi. Jälkeenpäin 20 mg ksylatsiinia injektoitiin selkäsuoneen kaniinien lopettamiseksi niiden nukutuksen aikana (35).

Verinäytteenotto: Keskikorvavaltimon (36) tai lateraalisen nivellaskimon keräämiseksi valitaan 4 ml verta päivänä 0, 8 viikon kuluttua ja 12 viikon lopussa. Näyte kerätään seerumin erotusputkeen tutkimuksia varten, kuten veren lyijymäärä, alkalinen fosfataasi, kalsium- ja fosfaattitaso.

Kudosnäytteenottotekniikka:

Tutkimuksiin otetaan 4x5 mm2 osa kruunun labiaalin pinnan keskikolmanneksesta. Leikkaus tehdään timanttilevyllä ja nopealla turbiinilla, joka kastelee vettä munamaiseksi näytteen ylikuumenemiseksi. Kaikkien kanien oikeat alaleuan etuhampaat valitaan SEM:lle ja AFM:lle. Kaikkien kanien vasemmat alaleuan etuhampaat valitaan SEM-EDX- ja RMS-analyysillä. Kaikki näytteet merkitään ja niitä säilytetään steriloidussa astiassa, jossa on 12 % formaliinia 72 tunnin ajan.

Laboratoriokäsittely:

1. Pyyhkäisyelektronimikroskoopia: Oikea alaleuan etuhammas valitaan SEM-analyysiä varten. Kiilteen rakenne ja morfologiset piirteet tulevat näkyviin kuvista. Näyte pestään tislatulla vedellä ja kuivataan kuumailmapuhaltimella hitaalla nopeudella. Kuusitoista näytettä voidaan kiinnittää näytepistokkeeseen kerrallaan. Näytteet kiinnitetään pistoon kaksinkertaisella kupariteipillä. Myös paljastunut puukko peitetään kupariteipillä ja vain näyteosa jätetään peittämättä.

   Kultapinnoitus tehdään sputteripäällystyskoneessa pintajohtimen valmistamiseksi kuvien hienoille yksityiskohdille. Näytepistoke asetetaan sputterointikoneen kammioon ja kansi suljetaan. Kammion sisällä syntyy tyhjiö ja täytetään argonkaasua. Potentiaalia annetaan 40 volttia. Tämän seurauksena kammion sisällä muodostuu plasmaa ja argonkaasun elektronit iskevät kultalevyyn. Pienet kultahiukkaset alkavat roiskua näytepistoksen yhteydessä. Kun kultapinnoitus on tehty, menettely on päinvastainen. Kammio täytetään ilmalla ja kansi avataan. Nyt näyte käsitellään NOVA NANOSEM 450:ssä ultrarakenteisten yksityiskohtien saamiseksi.

2. Energiadispersiospektroskopia: EDX:ää käytetään mineraalisisällön alkuainekoostumuksen tutkimiseen. OXFORD X-ACT, PENTA FET -ilmaisin liitetään NOVA NANOSEM 450:een. SEM-analyysiin käytettyä näytettä käytetään myös SEM-EDX-analyysiin. Tämä antaa pinnalle yksityiskohtia, joiden paksuus on enintään 2 mikronia.

3. Atomic Force Microscope: AFM:ää (SPM-9500J3, Shimadzu Corp, Japani) käytetään emalin pinnan morfologisten piirteiden arvioimiseen. Se tarjoaa kolmiulotteisen pinnan topografian ilman näytteen valmistelua. Tämä mikroskopia on suunniteltu skannaamaan näyte koettimella. Näyte kiinnitetään tyngään, joka kiinnitetään ja säädetään manuaalisesti. Lasersäätö tehdään anturin taajuuden määrittämisen jälkeen. Lopuksi skannaus ja kuvankäsittely tehdään WinSPM-järjestelmäkäsittelyllä. Yhdestä edustavasta näytteestä otetaan mikrokuvat kuudelta eri alueelta (2,0 × 2,0 μm:n skannausalue) käyttämällä AFM:ää (SPM-9500J3, Shimadzu Corp, Japani) ja AFM-ohjelmistoa (SPM-Offline, Shimadzu Corp, Japani).

   AFM luo pinnasta 3D-kuvia skannaamalla pinnan poikki mikronin kokoisen ulokkeen, joka on tyypillisesti valmistettu piistä tai piinitridistä, kärjellä, jonka kaarevuussäde on ~10nm. Uloke poikkeutetaan kärjen ja pinnan välisillä voimilla, jotka ovat ~nN ja sisältävät sähköstaattisten voimien, solvataatiovoimien, Vander Waalsin vuorovaikutusten ja kemiallisen sidoksen vaikutuksen. Tämä ulokkeen taipuma mitataan laserpisteellä, joka heijastuu ulokkeen yläpinnasta valodiodeihin, jotka muodostavat kuvia tietokoneessa.

4. Raman-spektroskopia: Se on tuhoamaton kemiallinen analyysitekniikka, joka tarjoaa yksityiskohtaista tietoa kemiallisesta rakenteesta, kiteisyydestä ja molekyylien vuorovaikutuksista. RMS antaa meille yksityiskohdat emalin koko paksuudesta molekyylikoostumuksesta ja sen vuorovaikutuksesta näytteen kanssa. Tätä analyysiä varten ei tarvita erityistä näytteen valmistelua ja näytettä voidaan käyttää myös muihin tutkimuksiin. Tässä tutkimuksessa käytetään RENISHAW UK:n InVia Raman -mikroskooppia. Laserintensiteettiä 488 nm käytetään 10 sekunnin ajan. RMS tehdään 6 eri pisteessä ja keskiarvoa käytetään tutkimuksessa.