Efeitos do extrato de Allium Sativum e Moringa Oleifera no esmalte dental

Este estudo experimental em animais será realizado no Animal House, University of Health Sciences, Lahore (UHS) e COMSATS University, Lahore. Para este estudo, cinquenta e quatro coelhos NewZeeland brancos machos saudáveis ​​(9 a 10 semanas) serão levados para o estudo. Os coelhos serão divididos aleatoriamente em 6 grupos. O tamanho da amostra será de 9 coelhos em cada grupo. Os animais experimentais receberão os números 1,2,3,4, até 54 usando o gerador de números aleatórios e serão divididos aleatoriamente em seis grupos (n = 9) e serão designados como grupo A, B, C, D, E e F. Coelhos brancos machos saudáveis ​​da Nova Zelândia pesando 1.000-1.200 gramas (Idade 9-10 semanas) serão selecionados da University of Veterinary and Animal Sciences, Lahore. Os animais serão encaminhados para biotério do SUS. Os animais serão mantidos em laboratório de pesquisa experimental em temperatura ambiente controlada (22-24°C) e umidade (45-65%) sob ciclo de 12/12 horas de luz natural e escuro por 2 semanas para aclimatação em novo ambiente. Todos os animais experimentais serão alimentados com vegetais, frutas e água destilada ad libitum. Ao final de 12 semanas, todos os animais serão sacrificados sob anestesia profunda. Cloridrato de cetamina 45 mg/kg b.w e xilazina 5 mg/kg b.w I/M serão administrados para manter a anestesia profunda. Em seguida, 20 mg de xilazina foram injetados na veia do pavilhão auricular para sacrificar os coelhos enquanto estavam anestesiados.(35).

Coleta de Sangue: A Artéria Auricular Central(36) ou a veia safena lateral serão selecionadas para coleta de 4 ml de sangue no dia 0, após 8 semanas e ao final de 12 semanas. A amostra será coletada em tubo separador de soro para investigações como hemograma, fosfatase alcalina, nível de cálcio e fosfato.

Técnica de Amostragem de Tecido:

Uma porção de 4x5 mm2 do terço médio da superfície labial da coroa será tomada para investigações. O corte será feito por disco diamantado e turbina de alta rotação com irrigação de água para ovóide sobre aquecimento da amostra. Os incisivos inferiores direitos de todos os coelhos serão selecionados para SEM e AFM. Os incisivos inferiores esquerdos de todos os coelhos serão selecionados por SEM-EDX e analisados ​​por RMS. Todas as amostras serão rotuladas e armazenadas em recipiente esterilizado com formol a 12% por 72 horas.

Processamento de Laboratório:

1. Microscopia Eletrônica de Varredura: O incisivo inferior direito será selecionado para análise SEM. A estrutura e características morfológicas do esmalte serão vistas por suas imagens. A amostra será lavada com água destilada e será seca por soprador de ar quente em velocidade lenta. Dezesseis amostras podem ser fixadas em uma punhalada de amostra por vez. As amostras serão fixadas em facada por fita dupla de cobre. A facada exposta também será coberta por fita de cobre e apenas a parte da amostra ficará descoberta.

   O revestimento de ouro será feito na máquina de revestimento por pulverização para tornar a superfície condutora para detalhes finos de imagens. A ponta da amostra será colocada na câmara da máquina de pulverização e a tampa será fechada. Dentro da câmara, o vácuo será criado e o gás argônio será preenchido. Potencial de 40 volts será dado. Por este plasma será formado dentro da câmara e os elétrons do gás argônio irão atingir a placa de ouro. As minúsculas partículas de ouro começarão a esguichar na amostra. Uma vez feito o revestimento de ouro, o procedimento será revertido. A câmara será preenchida com ar e a tampa será aberta. Agora a amostra será processada em NOVA NANOSEM 450 para detalhes ultraestruturais.

2. Espectroscopia de Dispersão de Energia: EDX será usado para estudar a composição elementar do conteúdo mineral. Um detector de OXFORD X-ACT, PENTA FET será anexado ao NOVA NANOSEM 450. A mesma amostra usada para SEM também será usada para análise SEM-EDX. Isso fornecerá detalhes na superfície de até 2 mícrons de espessura.

3. Microscópio de Força Atômica: AFM (SPM-9500J3, Shimadzu Corp, Japão) será utilizado para a avaliação das características morfológicas da superfície do esmalte. Ele fornece a topografia de superfície tridimensional sem qualquer preparação de amostra. Esta microscopia é projetada para escanear a amostra com uma sonda. A amostra será anexada no stub, que será fixado e ajustado manualmente. O ajuste do laser será feito após a determinação da frequência da sonda. Por fim, a digitalização e o processamento da imagem serão feitos com o processamento do sistema WinSPM. Para uma amostra representativa, micrografias em seis áreas diferentes (área de varredura de 2,0 × 2,0 μm) serão tiradas usando AFM (SPM-9500J3, Shimadzu Corp, Japão) e software AFM (SPM-Offline, Shimadzu Corp, Japão).

   O AFM cria imagens 3D de uma superfície digitalizando um cantilever do tamanho de um mícron na superfície, que normalmente é feito de silício ou nitreto de silício, com uma ponta cujo raio de curvatura é de aproximadamente 10 nm. O cantilever é desviado pelas forças entre a ponta e a superfície, que são ~nN e incluem contribuições de forças eletrostáticas, forças de solvatação, interações de Vander Waals e ligações químicas. Essa deflexão do cantilever é medida por um ponto de laser refletindo da superfície superior do cantilever em uma matriz de fotodiodos, que fornece imagens no computador.

4. Espectroscopia Raman: É uma técnica de análise química não destrutiva que fornece informações detalhadas sobre estrutura química, cristalinidade e interações moleculares. O RMS nos dará os detalhes de toda a espessura do esmalte sobre a composição molecular e sua interação com a amostra. Nenhuma preparação especial da amostra será necessária para esta análise e a amostra também pode ser usada para outras investigações. O microscópio InVia Raman da RENISHAW UK será usado para este estudo. A intensidade do laser 488nm será usada por 10 segundos. O RMS será feito em 6 pontos diferentes e a leitura média será usada no estudo.