Reaktivace CMV u akutní nekrotizující pankreatitidy

Východiska a zdůvodnění studie Akutní pankreatitida je jedno z často se vyskytujících systémových onemocnění s širokým spektrem projevů od mírného onemocnění, které má lepší výsledky ve srovnání s těžkým onemocněním, které obvykle vede k přijetí na jednotku intenzivní péče (JIP), a je spojena s vysokou mortalitou. Podle revidované klasifikace z Atlanty (2012) je nyní akutní pankreatitida rozdělena na dva odlišné podtypy, nekrotizující pankreatitidu a intersticiální edematózní pankreatitidu (IEP), na základě přítomnosti nebo nepřítomnosti nekrózy. U těžké akutní pankreatitidy vede zánět k nahromadění peri-pankreatické tekutiny, z nichž jsou identifikovány čtyři různé podtypy. Akutní nekrotické kolekce (ANC) a walled-off necrosis (WON), které se vyskytují u pacientů s nekrotizující pankreatitidou, obsahují různá množství tekutiny a nekrotických zbytků, které mohou být buď sterilní, nebo infekční. Úmrtnost na sterilní nekrózu zůstává poměrně nízká (5%-10%), ale superinfekce nekrotického pankreatu a peri-pankreatické tkáně/tekutiny významně zvyšují míru úmrtnosti (20%-30%).

Infikované pankreatické nekrosum při kultivaci obvykle vykazuje monomikrobiální flóru u 60–87 % pacientů a polymikrobiální flóru u 13–40 % pacientů. Nejběžnější izolované organismy jsou gramnegativní bakterie, především Escherichia coli a Klebsiella pneumonia následované grampozitivními bakteriemi. Se zvýšeným používáním antibiotické terapie na JIP roste také výskyt plísňových infekcí slinivky břišní. Plísňové infekce slinivky břišní, způsobené převážně druhy Candida, byly identifikovány až u poloviny s delší hospitalizací a nižším ročním přežitím než u pacientů pouze s bakteriálními infekcemi slinivky.

Tradičně byli kriticky nemocní pacienti považováni za imunokompetentní, ale přítomnost sepse a její imunomodulační účinky mohou vést k reaktivaci dormantních virových infekcí. V posledních letech byla zjištěna reaktivace cytomegaloviru (CMV) u kriticky nemocných pacientů s až 71% incidencí. Sepse díky svým imunomodulačním účinkům může vést k reaktivaci CMV v důsledku uvolňování prozánětlivých cytokinů, jako jsou TNF-alfa a IL-1beta, které mají schopnost aktivovat několik transkripčních faktorů přispívajících k reaktivaci CMV. Studie ukázaly, že infekce CMV u kriticky nemocných pacientů byla konzistentně spojena s nedetekovatelnými odpověďmi IFN-y T buněk během prvních 2 dnů po přijetí na JIP a že virová zátěž byla nepřímo úměrná odpovědím IFN-y T buněk. Podobné výsledky byly nalezeny u septických pacientů, kteří vykazují paralýzu imunitního systému, sníženou funkci Th1 buněk, zvýšenou produkci IL-10 (protizánětlivé) a globální lymfopenii ovlivňující přirozené zabíječe (NK) kvantitativně a kvalitativně související s jejich produkcí interferonu.

Studie dokumentovaly významně vyšší míru selhání orgánů a mortalitu u kriticky nemocných pacientů s reaktivací CMV. V systematickém přehledu zkoumajícím souvislost mezi reaktivací CMV a klinickými výsledky u imunokompetentních kriticky nemocných pacientů, včetně 22 studií, byla reaktivace CMV spojena se zvýšenou mortalitou na JIP, celkovou mortalitou, délkou mechanické ventilace, nozokomiálními infekcemi a délkou trvání JIP. pobyt. Reaktivace CMV byla také studována u specifických kriticky nemocných kohort, což prokázalo jejich vliv na mortalitu. Byl také studován účinek reaktivace CMV na mortalitu u pacientů s imunokompetentním syndromem akutní respirační tísně (ARDS). Z 399 pacientů s ARDS bylo 68 % CMV séropozitivních a k reaktivaci došlo u 27 % z nich, což bylo spojeno s celkově zvýšenou mortalitou na JIP. V jiné studii mezi kohortou septického šoku (329 pacientů) byly reaktivace herpesviru dokumentovány u 68 % pacientů bez předchozí imunodeficience a došlo k závěru, že reaktivace mohou být nezávisle spojeny s mortalitou.

V současné době však nejsou k dispozici žádné studie zkoumající reaktivaci CMV u pacientů s akutní nekrotizující pankreatitidou (ANP). Výzkumníci se zaměřili na studium prevalence reaktivace CMV a kinetiky její virové zátěže u kriticky nemocných pacientů s ANP

Cíle Studovat prevalenci reaktivace cytomegaloviru (CMV) a kinetiku jeho virové nálože u kriticky nemocných dospělých pacientů s akutní nekrotizující pankreatitidou

Metodologie Návrh studie Tato prospektivní observační studie bude provedena na Oddělení kritické péče ve spolupráci s Ústavem gastroenterologie a mikrobiologie, SGPGIMS, Lucknow po schválení Institucionální etickou komisí (IEC).

Protokol studie Během období studie budou zvažováni zařazení všichni dospělí pacienti na JIP s diagnózou akutní nekrotizující pankreatitidy. Podle kritérií pro zařazení a vyloučení budou tito pacienti vyšetřeni na přítomnost anti CMV IgG protilátek v jejich krvi. Pokud je pacient IgG séropozitivní a splňuje kritéria pro zařazení/vyloučení, bude zařazen do studie a během pobytu na JIP bude sledován kvůli reaktivaci CMV. U pacientů s reaktivací CMV bude kinetika virové zátěže dále sledována po další 2 týdny.

Odběr vzorků Vzorky krve: 1,0 ml krve bude odebráno do lahvičky s EDTA ze stávajícího žilního katétru, každý týden, aby se zjistila reaktivace CMV během pobytu na JIP nebo 10. týdne nemoci (podle toho, co nastane dříve).

Perkutánní drén: Pokud měl pacient abdominální drén v blízkosti slinivky břišní, bude mu každý týden odebráno 2,0 ml do sterilní nádobky za účelem zjištění reaktivace CMV během pobytu na JIP nebo v 10. týdnu nemoci (podle toho, co nastane dříve).

Pankreatické nekrosum: Pokud pacient podstoupil nekrosektomii, bude pankreatické nekrosum odebráno do sterilní nádoby (jednorázově)

Laboratorní analýza ELISA pro detekci IgG protilátek: Odebrané sérum bude testováno na IgG protilátky metodou ELISA podle doporučení výrobce. (Abbott Laboratories, Abbott Park, IL). Hraniční hodnota bude výrobcem soupravy nastavena na 0,5 WHO IU/ml (kalibrátor 2). Vzorky s koncentrací vyšší než 0,5 WHO IU/ml budou považovány za pozitivní na CMV IgG. Všechny vzorky budou testovány duplicitně.

CMV kvantitativní PCR v reálném čase:

Extrakce DNA: Extrakce DNA bude provedena na 200 μl vzorku pomocí soupravy QIAamp DNA kit (Qiagen, Inc., Valencia, Kalifornie). Poté se k eluci DNA použije 60 μl Tris (10 mM, pH 8,0) a pro každou PCR se použije 10 μl DNA. Extrahovaná DNA bude uložena při -800 C pro další práci.

Kvantitativní Real-time PCR pro detekci viru: Připraví se 25 μl reakce pro detekci CMV pomocí RTPCR s použitím 10 μl extrahované DNA, 12,5 μl 2X PCR pufru a 1,5 μl AgPath RT-PCR reagencií (Thermo Fisher Scientific , Massachusetts USA) a 1 μl primeru a sekvence sond popsané jinde. Všechny oligonukleotidy budou syntetizovány a získány od společnosti Thermo Fisher Scientific, USA a tepelné cyklování bude provedeno při 95 °C po dobu 3 minut a poté 40 cyklů 95 °C po dobu 15 s, 58 °C po dobu 30 s použitím Applied bio system 7500 Systém Real-Time PCR (Thermo Fisher Scientific, Massachusetts USA). Každý test se bude skládat z 5 kvantitativních kontrol a výsledky budou podle toho interpretovány.

Definice Akutní nekrotizující pankreatitida: Tato bude diagnostikována na základě klinických příznaků/laboratorních parametrů a přítomnosti nezvětšujících se oblastí pankreatu na kontrastním CT (CECT) vyšetření.

Reaktivace CMV: Mezní hodnota pro diagnostiku reaktivace CMV bude brána jako hodnota >1000 kopií/ml.

Sběr dat Demografické a relevantní klinické charakteristiky zahrnutých pacientů budou shromážděny na formuláři strukturované kazuistiky.

Velikost vzorku a statistická analýza Mezi screeningovou akutní nekrotizující pankreatitidou se očekává, že 95 % pacientů bude mít séropozitivní IgG. Za předpokladu, že u 50 % séropozitivních (IgG) pacientů dojde během pobytu na JIP k reaktivaci cytomegaloviru (CMV). Vezmeme-li 15% chybovost v předpokládané prevalenci (tj. očekávaný rozsah 35 až 65 %), při oboustranném 95% intervalu spolehlivosti je odhadovaná velikost vzorku 43. Tato studie je časově omezena na 18 měsíců, takže během období studie budou všichni vhodní pacienti vyšetřeni a zváženo zařazení do této studie. Vyšetřovatelé očekávají asi 50 pacientů.

Popisné statistiky spojitých proměnných mají být prezentovány jako průměr ± směrodatná odchylka/medián (mezikvartilové rozmezí), zatímco kategoriální proměnné v četnosti (%) podle potřeby. Studentův t-test (nezávislý i t-test párových vzorků podle potřeby) nebo jeho neparametrické metody, které se použijí k porovnání průměrů/mediánů mezi dvěma skupinami, přičemž bude použit Chí-kvadrát test nebo Fisherův exaktní test. pro srovnání proporcí. Incidence reaktivací CMV bude vypočítána a tato souvislost s demografickými a klinickými faktory bude posouzena pomocí jednorozměrných i vícerozměrných Coxových modelů proporcionálního rizika. P-hodnota < 0,05 bude považována za statisticky významnou. Pro analýzu dat bude použit statistický balík pro společenské vědy verze 23 (SPSS-23, IBM, Chicago, USA) a MedCalc Software.