Реактивация ЦМВ при остром некротическом панкреатите

Предпосылки и обоснование исследования Острый панкреатит является одним из часто встречающихся системных заболеваний, проявляющихся широким спектром проявлений, начиная от легкого заболевания с лучшим исходом по сравнению с тяжелым заболеванием, которое обычно приводит к госпитализации в отделение интенсивной терапии (ОИТ), и связано с высокой смертностью. Согласно пересмотренной классификации Атланты (2012 г.), острый панкреатит в настоящее время делится на два различных подтипа, некротизирующий панкреатит и интерстициальный отечный панкреатит (ИЭП), в зависимости от наличия или отсутствия некроза. При тяжелом остром панкреатите воспаление приводит к перипанкреатическим скоплениям жидкости, четыре различных подтипа которых идентифицированы. Острые некротические скопления (ОНК) и отграниченный некроз (ВОН), которые возникают у пациентов с некротизирующим панкреатитом, содержат различное количество жидкости и некротических остатков, которые могут быть как стерильными, так и инфекционными. Показатели смертности от стерильного некроза остаются сравнительно низкими (5-10%), но суперинфекция некротизированной поджелудочной железы и парапанкреатических скоплений ткани/жидкости значительно увеличивает уровень смертности (20-30%).

Инфицированный панкреонекроз при культивировании обычно демонстрирует мономикробную флору у 60-87% больных и полимикробную флору у 13-40% больных. Наиболее распространенными выделенными микроорганизмами являются грамотрицательные бактерии, в основном Escherichia coli и Klebsiella pneumonia, за которыми следуют грамположительные бактерии. С увеличением использования антибиотиков в отделении интенсивной терапии также растет заболеваемость грибковыми инфекциями поджелудочной железы. Грибковые инфекции поджелудочной железы, преимущественно вызванные видами Candida, были выявлены в половине случаев с более длительным пребыванием в стационаре и более низкой годовой выживаемостью, чем у пациентов только с бактериальными инфекциями поджелудочной железы.

Традиционно больных в критическом состоянии считали иммунокомпетентными, но наличие сепсиса и его иммуномодулирующие эффекты могут привести к реактивации дремлющих вирусных инфекций. В последние годы реактивация цитомегаловируса (ЦМВ) у пациентов в критическом состоянии была выявлена ​​с частотой до 71%. Сепсис из-за его иммуномодулирующего действия может привести к реактивации ЦМВ из-за высвобождения провоспалительных цитокинов, таких как ФНО-альфа и ИЛ-1бета, которые обладают способностью активировать несколько факторов транскрипции, способствующих реактивации ЦМВ. Исследования показали, что ЦМВ-инфекция у пациентов в критическом состоянии постоянно ассоциировалась с неопределяемым ответом Т-клеток на IFN-γ в течение первых 2 дней после поступления в отделение интенсивной терапии, и что вирусная нагрузка была обратно пропорциональна ответу Т-клеток на IFN-γ. Аналогичные результаты были обнаружены у пациентов с сепсисом, у которых наблюдается паралич иммунной системы, сниженная функция клеток Th1, повышенная продукция IL-10 (противовоспалительное действие) и глобальная лимфопения, затрагивающая естественные клетки-киллеры (NK), количественно и качественно связанные с их продукцией интерферона.

Исследования задокументировали значительно более высокие показатели органной недостаточности и смертности у пациентов в критическом состоянии с реактивацией ЦМВ. В систематическом обзоре, посвященном изучению связи между реактивацией ЦМВ и клиническими исходами у иммунокомпетентных пациентов в критическом состоянии, включая Itwenty-two, реактивация ЦМВ была связана с повышенной смертностью в ОИТ, общей смертностью, продолжительностью ИВЛ, внутрибольничными инфекциями и продолжительностью пребывания в ОИТ. оставаться. Реактивация цитомегаловируса также изучалась у конкретных когорт больных в критическом состоянии, демонстрируя их влияние на смертность. Также изучалось влияние реактивации ЦМВ на смертность у пациентов с иммунокомпетентным острым респираторным дистресс-синдромом (ОРДС). Из 399 пациентов с ОРДС 68 % были серопозитивными по ЦМВ, а реактивация произошла у 27 % из них, что было связано с общим повышением смертности в ОИТ. В другом исследовании среди пациентов с септическим шоком (329 пациентов) реактивация герпесвируса была зарегистрирована у 68% пациентов без предшествующего иммунодефицита, и был сделан вывод о том, что реактивация может быть независимо связана со смертностью.

Однако в настоящее время нет исследований реактивации ЦМВ у пациентов с острым некротизирующим панкреатитом (ОНП). Исследователи стремились изучить распространенность реактивации ЦМВ и кинетику его вирусной нагрузки у пациентов в критическом состоянии с ПНП.

Цели. Изучение распространенности реактивации цитомегаловируса (ЦМВ) и кинетики его вирусной нагрузки у взрослых пациентов в критическом состоянии с острым некротизирующим панкреатитом.

Методология Дизайн исследования Это проспективное обсервационное исследование будет проводиться в отделении интенсивной терапии в сотрудничестве с отделением гастроэнтерологии и микробиологии, SGPGIMS, Лакхнау, после одобрения Институциональным этическим комитетом (IEC).

Протокол исследования В течение периода исследования будут рассматриваться все взрослые пациенты ОИТ с диагнозом острого некротизирующего панкреатита. В соответствии с критериями включения и исключения, эти пациенты будут обследованы на наличие антител IgG к ЦМВ в их крови. Если пациент является серопозитивным по IgG и соответствует критериям включения/исключения, то он будет включен в исследование и будет наблюдаться на предмет реактивации ЦМВ во время пребывания в отделении интенсивной терапии. У пациентов с реактивацией ЦМВ в течение следующих 2 недель будет дополнительно наблюдаться кинетика вирусной нагрузки.

Сбор образцов Образцы крови: 1,0 мл крови будет собираться во флакон с ЭДТА из существующего венозного катетера еженедельно для обнаружения реактивации ЦМВ во время пребывания в отделении интенсивной терапии или на 10-й неделе болезни (в зависимости от того, что наступит раньше).

Чрескожный дренаж: если у пациента был абдоминальный дренаж в непосредственной близости от поджелудочной железы, еженедельно будет собираться 2,0 мл в стерильный контейнер для выявления реактивации ЦМВ во время пребывания в отделении интенсивной терапии или на 10-й неделе болезни (в зависимости от того, что наступит раньше).

Некроз поджелудочной железы: если пациент перенес некрозэктомию, то некроз поджелудочной железы будет собран в стерильный контейнер (однократно)

Лабораторный анализ ELISA для обнаружения антител IgG: Собранная сыворотка будет проверена на наличие антител IgG с помощью ELISA в соответствии с рекомендациями производителя. (Эббот Лабораториз, Эббот Парк, Иллинойс). Пороговое значение будет установлено производителем набора на уровне 0,5 ВОЗ МЕ/мл (Калибратор 2). Образцы с концентрацией выше 0,5 ВОЗ МЕ/мл будут считаться положительными на CMV IgG. Все образцы будут тестироваться в двух экземплярах.

Количественная ПЦР в реальном времени ЦМВ:

Экстракция ДНК: экстракцию ДНК проводят на 200 мкл образца с использованием набора ДНК QIAamp (Qiagen, Inc., Валенсия, Калифорния). Затем 60 мкл Трис (10 мМ, рН 8,0) будут использовать для элюирования ДНК, и 10 мкл ДНК будут использовать для каждой ПЦР. Извлеченная ДНК будет храниться при температуре -800 С для дальнейшей работы.

Количественная ПЦР в реальном времени для обнаружения вируса: 25 мкл реакции готовят для обнаружения ЦМВ с помощью RTPCR с использованием 10 мкл экстрагированной ДНК, 12,5 мкл 2X ПЦР-буфера и 1,5 мкл реагентов AgPath RT-PCR (Thermo Fisher Scientific , Массачусетс, США) и 1 мкл последовательностей праймеров и зондов, описанных в другом месте. Все олигонуклеотиды будут синтезированы и приобретены у компании Thermo Fisher Scientific, США, а термоциклирование будет проведено при 95 °C в течение 3 минут, а затем 40 циклов при 95 °C в течение 15 секунд, 58 °C в течение 30 секунд с использованием Applied bio system 7500. Система ПЦР в реальном времени (Thermo Fisher Scientific, Массачусетс, США). Каждый тест будет состоять из 5 количественных контролей, и результаты будут интерпретироваться соответствующим образом.

Определения Острый некротизирующий панкреатит: Диагноз ставится на основании клинических признаков/симптомов/лабораторных показателей и наличия неконтрастных участков поджелудочной железы на КТ с контрастным усилением (CECT).

Реактивация ЦМВ. Пороговым значением для диагностики реактивации ЦМВ будет значение >1000 копий/мл.

Сбор данных Демографические и соответствующие клинические характеристики включенных пациентов будут собраны в структурированной форме истории болезни.

Размер выборки и статистический анализ Ожидается, что у 95% пациентов, прошедших скрининг острого некротического панкреатита, будут серопозитивны IgG. Предполагая, что у 50% серопозитивных (IgG) пациентов разовьется реактивация цитомегаловируса (ЦМВ) во время пребывания в отделении интенсивной терапии. Принимая 15% погрешность предполагаемой распространенности (т. ожидаемый диапазон от 35 до 65%), при двустороннем 95% доверительном интервале расчетный размер выборки составляет 43. Это исследование ограничено по времени 18 месяцами, поэтому в течение периода исследования все подходящие пациенты будут проверены и рассмотрены для включения в это исследование. Следователи ожидают около 50 пациентов.

Описательная статистика непрерывных переменных должна быть представлена ​​как среднее значение ± стандартное отклонение/медиана (межквартильный диапазон), а категориальные переменные - в виде частоты (%), в зависимости от обстоятельств. Критерий Стьюдента (независимый, а также t-критерий для парных выборок, если применимо) или его непараметрические методы, которые будут использоваться для сравнения средних/медиан между двумя группами, тогда как будет использоваться критерий хи-квадрат или точный критерий Фишера. сравнить пропорции. Будет рассчитана частота реактивации ЦМВ, и эта связь с демографическими и клиническими факторами будет оценена с использованием одномерных, а также многомерных моделей пропорциональных рисков Кокса. Значение p < 0,05 будет считаться статистически значимым. Статистический пакет для социальных наук, версия-23 (SPSS-23, IBM, Чикаго, США) и программное обеспечение MedCalc будут использоваться для анализа данных.