CMV-Reaktivierung bei akuter nekrotisierender Pankreatitis

Hintergrund und Begründung der Studie Akute Pankreatitis ist eine der am häufigsten auftretenden systemischen Erkrankungen mit einem breiten Spektrum an Erscheinungsformen, das von einer leichten Erkrankung mit besserem Ausgang bis zu einer schweren Erkrankung reicht, die normalerweise zur Einweisung auf die Intensivstation (ICU) führt. und ist mit einer hohen Sterblichkeit verbunden. Gemäß der überarbeiteten Atlanta-Klassifikation (2012) wird die akute Pankreatitis nun in zwei verschiedene Subtypen unterteilt, die nekrotisierende Pankreatitis und die interstitielle ödematöse Pankreatitis (IEP), basierend auf dem Vorhandensein oder Fehlen einer Nekrose. Bei schwerer akuter Pankreatitis führt die Entzündung zu peripankreatischen Flüssigkeitsansammlungen, von denen vier verschiedene Subtypen identifiziert werden. Akute nekrotische Ansammlungen (ANC) und „Walled-Off-Nekrose“ (WON), die bei Patienten mit nekrotisierender Pankreatitis auftreten, enthalten unterschiedliche Mengen an Flüssigkeit und nekrotischen Ablagerungen, die entweder steril oder infektiös sein können. Die Sterblichkeitsraten bei steriler Nekrose bleiben vergleichsweise niedrig (5–10 %), eine Superinfektion der nekrotischen Bauchspeicheldrüse und der peripankreatischen Gewebe-/Flüssigkeitsansammlungen erhöht die Sterblichkeitsrate jedoch erheblich (20–30 %).

Das infizierte Pankreasnekrosum zeigt bei Kultur normalerweise bei 60–87 % der Patienten eine monomikrobielle Flora und bei 13–40 % der Patienten eine polymikrobielle Flora. Die am häufigsten isolierten Organismen sind gramnegative Bakterien, hauptsächlich Escherichia coli und Klebsiella pneumonia, gefolgt von grampositiven Bakterien. Mit dem zunehmenden Einsatz von Antibiotikatherapien auf der Intensivstation steigt auch die Häufigkeit von Pilzinfektionen der Bauchspeicheldrüse. Pilzinfektionen der Bauchspeicheldrüse, die überwiegend durch Candida-Arten verursacht werden, wurden bei bis zu der Hälfte der Patienten mit einem längeren Krankenhausaufenthalt und einer geringeren Ein-Jahres-Überlebensrate festgestellt als bei Patienten mit ausschließlich bakteriellen Bauchspeicheldrüseninfektionen.

Traditionell galten kritisch kranke Patienten als immunkompetent, doch das Vorliegen einer Sepsis und ihrer immunmodulatorischen Wirkung kann zur Reaktivierung ruhender Virusinfektionen führen. In den letzten Jahren wurde eine Reaktivierung des Zytomegalievirus (CMV) bei kritisch kranken Patienten mit einer Inzidenz von bis zu 71 % festgestellt. Sepsis kann aufgrund ihrer immunmodulatorischen Wirkung zur Reaktivierung von CMV führen, da proinflammatorische Zytokine wie TNF-alpha und IL-1beta freigesetzt werden, die mehrere Transkriptionsfaktoren aktivieren können, die zur CMV-Reaktivierung beitragen. Studien zeigten, dass eine CMV-Infektion bei kritisch kranken Patienten durchgängig mit nicht nachweisbaren IFN-γ-T-Zell-Reaktionen innerhalb der ersten zwei Tage nach der Aufnahme auf die Intensivstation verbunden war und dass die Viruslast umgekehrt mit den IFN-γ-T-Zell-Reaktionen zusammenhängt. Ähnliche Ergebnisse wurden bei septischen Patienten gefunden, die eine Lähmung des Immunsystems, eine verminderte Th1-Zellfunktion, eine erhöhte IL-10-Produktion (entzündungshemmend) und eine globale Lymphopenie aufweisen, die natürliche Killerzellen (NK) betrifft, die quantitativ und qualitativ mit ihrer Interferonproduktion in Zusammenhang stehen.

Studien haben eine deutlich höhere Organversagensrate und Mortalität bei kritisch kranken Patienten mit CMV-Reaktivierung dokumentiert. In einer systematischen Überprüfung zur Untersuchung des Zusammenhangs zwischen CMV-Reaktivierung und klinischen Ergebnissen bei immunkompetenten kritisch kranken Patienten, einschließlich zweiundzwanzig Studien, war CMV-Reaktivierung mit einer erhöhten Sterblichkeit auf der Intensivstation, Gesamtmortalität, Dauer der mechanischen Beatmung, nosokomialen Infektionen und der Dauer auf der Intensivstation verbunden bleiben. Die CMV-Reaktivierung wurde auch in bestimmten kritisch kranken Kohorten untersucht und zeigte ihren Einfluss auf die Mortalität. Die Auswirkung der CMV-Reaktivierung auf die Mortalität bei immunkompetenten Patienten mit akutem Atemnotsyndrom (ARDS) wurde ebenfalls untersucht. Von 399 ARDS-Patienten waren 68 % CMV-seropositiv und bei 27 % kam es zu einer Reaktivierung, was mit einer insgesamt erhöhten Sterblichkeit auf der Intensivstation verbunden war. In einer anderen Studie in der Kohorte mit septischem Schock (329 Patienten) wurden Herpesvirus-Reaktivierungen bei 68 % der Patienten ohne vorherige Immunschwäche dokumentiert und kamen zu dem Schluss, dass Reaktivierungen unabhängig mit der Mortalität verbunden sein könnten.

Derzeit liegen jedoch keine Studien vor, die die CMV-Reaktivierung bei Patienten mit akuter nekrotisierender Pankreatitis (ANP) untersuchen. Ziel der Forscher war es, die Prävalenz der CMV-Reaktivierung und ihre Viruslastkinetik bei kritisch kranken Patienten mit ANP zu untersuchen

Ziele Untersuchung der Prävalenz der Reaktivierung des Zytomegalievirus (CMV) und seiner Viruslastkinetik bei kritisch kranken erwachsenen Patienten mit akuter nekrotisierender Pankreatitis

Methodik Studiendesign Diese prospektive Beobachtungsstudie wird in der Abteilung für Intensivmedizin in Zusammenarbeit mit der Abteilung für Gastroenterologie und Mikrobiologie, SGPGIMS, Lucknow nach Genehmigung durch das Institutional Ethics Committee (IEC).

Studienprotokoll Während des Studienzeitraums werden alle erwachsenen Intensivpatienten mit der Diagnose einer akuten nekrotisierenden Pankreatitis für die Aufnahme in Betracht gezogen. Gemäß den Einschluss- und Ausschlusskriterien werden diese Patienten auf das Vorhandensein von Anti-CMV-IgG-Antikörpern in ihrem Blut untersucht. Wenn der Patient IgG-seropositiv ist und die Einschluss-/Ausschlusskriterien erfüllt, wird er in die Studie aufgenommen und während seines Aufenthalts auf der Intensivstation auf CMV-Reaktivierung untersucht. Bei Patienten mit CMV-Reaktivierung wird die Viruslastkinetik in den nächsten zwei Wochen weiter verfolgt.

Probenentnahme Blutproben: 1,0 ml Blut werden wöchentlich in einem EDTA-Fläschchen aus einem vorhandenen Venenkatheter entnommen, um eine CMV-Reaktivierung während des Aufenthalts auf der Intensivstation oder in der 10. Krankheitswoche (je nachdem, was zuerst eintritt) festzustellen.

Perkutane Drainage: Wenn der Patient eine Bauchdrainage in der Nähe der Bauchspeicheldrüse hatte, werden wöchentlich 2,0 ml in einem sterilen Behälter gesammelt, um eine CMV-Reaktivierung während seines Aufenthalts auf der Intensivstation oder in der 10. Krankheitswoche (je nachdem, was zuerst eintritt) festzustellen.

Pankreasnekrosum: Wenn sich der Patient einer Nekrosektomie unterzogen hat, wird das Pankreasnekrosum in einem sterilen Behälter gesammelt (einmalig).

Laboranalyse ELISA zum Nachweis von IgG-Antikörpern: Das gesammelte Serum wird gemäß den Empfehlungen des Herstellers mittels ELISA auf IgG-Antikörper getestet. (Abbott Laboratories, Abbott Park, IL). Der Grenzwert wird vom Hersteller des Kits auf 0,5 WHO IU/ml (Kalibrator 2) festgelegt. Proben mit einer Konzentration von mehr als 0,5 WHO-IE/ml gelten als positiv für CMV-IgG. Alle Proben werden doppelt getestet.

CMV quantitative Echtzeit-PCR:

DNA-Extraktion: Die DNA-Extraktion wird an 200 μl einer Probe unter Verwendung eines QIAamp DNA-Kits (Qiagen, Inc., Valencia, Kalifornien) durchgeführt. Anschließend werden 60 μl Tris (10 mM, pH 8,0) zum Eluieren der DNA verwendet, und 10 μl der DNA werden für jede PCR verwendet. Die extrahierte DNA wird für die weitere Arbeit bei -800 °C gelagert.

Quantitative Echtzeit-PCR zum Virusnachweis: Für den Nachweis von CMV durch RTPCR wird eine 25-μL-Reaktion unter Verwendung von 10 μL extrahierter DNA, 12,5 μL 2X PCR-Puffer und 1,5 μL AgPath RT-PCR-Reagenzien (Thermo Fisher Scientific) vorbereitet , Massachusetts USA) und 1 μL Primer- und Sondensequenzen, die an anderer Stelle beschrieben sind. Alle Oligonukleotide werden synthetisiert und von Thermo Fisher Scientific, USA, bezogen, und thermische Zyklen werden bei 95 °C für 3 Minuten und dann 40 Zyklen von 95 °C für 15 Sekunden und 58 °C für die 30 Sekunden unter Verwendung des Applied Bio System 7500 durchgeführt Echtzeit-PCR-System (Thermo Fisher Scientific, Massachusetts, USA). Jeder Test besteht aus 5 quantitativen Kontrollen und die Ergebnisse werden entsprechend interpretiert.

Definitionen Akute nekrotisierende Pankreatitis: Diese wird auf der Grundlage klinischer Symptome/Laborparameter und des Vorhandenseins nicht kontrastmittelverstärkter Bereiche der Bauchspeicheldrüse bei einem kontrastmittelverstärkten CT-Scan (CECT) diagnostiziert.

CMV-Reaktivierung: Als Grenzwert für die Diagnose einer CMV-Reaktivierung gilt ein Wert von >1000 Kopien/ml.

Datenerhebungen Demografische und relevante klinische Merkmale der eingeschlossenen Patienten werden in einem strukturierten Fallberichtsformular erfasst.

Probengröße und statistische Analyse Unter den untersuchten akuten nekrotisierenden Pankreatitis-Patienten wird erwartet, dass 95 % der Patienten seropositiv für IgG sind. Unter der Annahme, dass 50 % der seropositiven (IgG) Patienten während des Aufenthalts auf der Intensivstation eine Reaktivierung des Zytomegalievirus (CMV) entwickeln. Geht man bei der angenommenen Prävalenz von einer Fehlerquote von 15 % aus (d. h. erwarteter Bereich von 35 bis 65 %; bei einem zweiseitigen 95 %-Konfidenzintervall beträgt die geschätzte Stichprobengröße 43. Diese Studie ist zeitlich begrenzt und dauert 18 Monate. Daher werden während des Studienzeitraums alle in Frage kommenden Patienten untersucht und für die Aufnahme in diese Studie in Betracht gezogen. Die Ermittler rechnen mit etwa 50 Patienten.

Beschreibende Statistiken der kontinuierlichen Variablen sind als Mittelwert ± Standardabweichung/Median (Interquartilbereich) darzustellen, kategoriale Variablen entsprechend in der Häufigkeit (%). Der Student-T-Test (sowohl unabhängiger als auch gepaarter Stichproben-T-Test) oder seine nichtparametrischen Methoden werden verwendet, um die Mittelwerte/Mediane zwischen den beiden Gruppen zu vergleichen, während der Chi-Quadrat-Test oder der exakte Fisher-Test verwendet werden um die Proportionen zu vergleichen. Die Inzidenz von CMV-Reaktivierungen wird berechnet und dieser Zusammenhang mit demografischen und klinischen Faktoren wird mithilfe univariater und multivariater Cox-Proportional-Hazard-Modelle bewertet. Ein p-Wert < 0,05 wird als statistisch signifikant angesehen. Für die Datenanalyse werden das Statistikpaket für Sozialwissenschaften, Version 23 (SPSS-23, IBM, Chicago, USA) und die MedCalc-Software verwendet.