CMV-reaktivering vid akut nekrotiserande pankreatit

Bakgrund och motivering för studien Akut pankreatit är en av de vanligaste systemiska sjukdomarna som uppvisar ett brett spektrum av presentationer som sträcker sig från mild sjukdom som har ett bättre resultat jämfört med svår sjukdom som vanligtvis leder till inläggning på intensivvårdsavdelningen (ICU), och är förknippad med hög dödlighet. Enligt den reviderade Atlanta-klassificeringen (2012) är akut pankreatit nu uppdelad i två distinkta subtyper, nekrotiserande pankreatit och interstitiell ödematös pankreatit (IEP), baserat på närvaro eller frånvaro av nekros. Vid svår akut pankreatit leder inflammation till peri-pankreatiska vätskesamlingar av vilka fyra distinkta undertyper identifieras. Akut nekrotisk samling (ANC) och walled-off nekros (WON) som förekommer hos patienter med nekrotiserande pankreatit, innehåller varierande mängder vätska och nekrotiskt skräp som antingen kan vara sterilt eller infektiöst. Dödligheten för steril nekros är fortfarande relativt låg (5%-10%), men superinfektion av den nekrotiska bukspottkörteln och peri-pankreatisk vävnad/vätskesamling ökar dödligheten avsevärt (20%-30%).

Den infekterade pankreasnekrosum uppvisar, när den odlas, vanligtvis monomikrobiell flora hos 60-87 % av patienterna och polymikrobiell flora hos 13-40 % av patienterna. De vanligaste isolerade organismerna är gramnegativa bakterier, främst Escherichia coli och Klebsiella pneumoni följt av grampositiva bakterier. Med den ökade användningen av antibiotikabehandlingar på intensivvårdsavdelningen ökar också förekomsten av svampinfektioner i bukspottkörteln. Svampinfektioner i bukspottkörteln, främst orsakade av Candida-arter, har identifierats på upp till hälften med en längre sjukhusvistelse och en lägre ettårsöverlevnad än patienter med endast bakteriella bukspottkörtelinfektioner.

Traditionellt har kritiskt sjuka patienter ansetts vara immunkompetenta men förekomsten av sepsis och dess immunmodulerande effekter kan leda till reaktivering av vilande virusinfektioner. Under de senaste åren har Cytomegalovirus (CMV) reaktivering hos kritiskt sjuka patienter erkänts med så hög incidens som 71 %. Sepsis på grund av dess immunmodulerande effekter kan leda till reaktivering av CMV på grund av frisättning av pro-inflammatoriska cytokiner såsom TNF-alfa och IL-1beta som har förmågan att aktivera flera transkriptionsfaktorer som bidrar till CMV-reaktivering. Studier visade att CMV-infektion hos kritiskt sjuka patienter konsekvent var associerad med odetekterbara IFN-γ T-cellsvar inom de första 2 dagarna efter inläggning på intensivvårdsavdelningen och att virusmängden var omvänt relaterad till IFN-γ T-cellssvar. Liknande resultat hittades hos septiska patienter som uppvisar förlamning av immunsystemet, minskad Th1-cellfunktion, ökad IL-10-produktion (antiinflammatorisk) och global lymfopeni som påverkar naturliga mördarceller (NK) kvantitativt och kvalitativt relaterat till deras interferonproduktion.

Studier har dokumenterat signifikant högre andelar av organsvikt och dödlighet hos kritiskt sjuka patienter med CMV-reaktivering. I en systematisk översikt för att undersöka sambandet mellan CMV-reaktivering och kliniska resultat hos immunkompetenta kritiskt sjuka patienter, inklusive tjugotvå studier, var CMV-reaktivering associerad med ökad ICU-mortalitet, total mortalitet, varaktighet av mekanisk ventilation, nosokomiala infektioner och ICU-längd av stanna kvar. CMV-reaktivering har också studerats i specifika kritiskt sjuka kohorter, vilket visar deras inverkan på dödligheten. Effekten av CMV-reaktivering på mortalitet hos patienter med immunkompetenta akut andnödssyndrom (ARDS) har också studerats. Av 399 ARDS-patienter var 68 % CMV-seropositiva och reaktivering inträffade hos 27 % av dem, vilket var associerat med totalt ökad ICU-mortalitet. I en annan studie bland den septiska chockkohorten (329 patienter) dokumenterades herpesvirusreaktiveringar hos 68 % av patienterna utan tidigare immunbrist, och drog slutsatsen att reaktiveringar oberoende kunde associeras med dödlighet.

Det finns dock inga studier tillgängliga för närvarande som undersöker CMV-reaktivering hos patienter med akut nekrotiserande pankreatit (ANP). Utredarna syftade till att studera prevalensen av CMV-reaktivering och dess virala belastningskinetik hos kritiskt sjuka patienter med ANP

Mål Att studera prevalensen av Cytomegalovirus (CMV) reaktivering och dess virala belastningskinetik hos kritiskt sjuka vuxna patienter med akut nekrotiserande pankreatit

Metod Studiedesign Denna prospektiva observationsstudie kommer att genomföras vid Institutionen för kritisk vårdmedicin i samarbete med Institutionen för gastroenterologi och mikrobiologi, SGPGIMS, Lucknow efter godkännande från den institutionella etiska kommittén (IEC).

Studieprotokoll Under studieperioden kommer alla vuxna intensivvårdspatienter med diagnosen akut nekrotiserande pankreatit att övervägas för inkludering. Enligt inklusions- och uteslutningskriterier kommer dessa patienter att screenas för förekomsten av Anti CMV IgG-antikroppar i blodet. Om patienten är IgG-seropositiv och uppfyller inklusions-/exklusionskriterierna kommer de att inkluderas i studien och följas upp för CMV-reaktivering under sin intensivvårdsvistelse. Hos patienter med CMV-reaktivering kommer viral belastningskinetik att följas upp ytterligare under de kommande 2 veckorna.

Provtagning Blodprover: 1,0 ml blod kommer att samlas in i en EDTA-flaska från en befintlig venkateter, varje vecka för att hitta CMV-reaktivering under deras intensivvårdsvistelse eller 10:e veckan av sjukdomen (beroende på vilket som inträffar först).

Perkutant dränering: Om patienten hade en abdominal dränering i närheten av bukspottkörteln, samlas 2,0 ml i en steril behållare varje vecka för att hitta CMV-reaktivering under sin intensivvårdsvistelse eller den 10:e veckan av sjukdomen (beroende på vilket som inträffar först).

Pankreatisk nekrosum: Om patienten genomgick nekrosektomi, kommer pankreasnekrosum att samlas upp i en steril behållare (en gång)

Laboratorieanalys ELISA för detektion av IgG-antikroppar: Det insamlade serumet kommer att testas för IgG-antikroppar med ELISA enligt tillverkarens rekommendationer. (Abbott Laboratories, Abbott Park, IL). Gränsvärdet för kommer att sättas till 0,5 WHO IE/ml (kalibrator 2) av kitets tillverkare. Prover med en koncentration högre än 0,5 WHO IE/ml kommer att anses vara positiva för CMV IgG. Alla prover kommer att testas i duplikat.

CMV kvantitativ realtids-PCR:

DNA-extraktion: DNA-extraktion kommer att utföras på 200 μl av ett prov med hjälp av ett QIAamp DNA-kit (Qiagen, Inc., Valencia, Kalifornien). Sedan kommer 60 μl Tris (10 mM, pH 8,0) att användas för att eluera DNA:t och 10 μl av DNA:t kommer att användas för varje PCR. Det extraherade DNA:t kommer att lagras vid -800 C för vidare arbete.

Kvantitativ realtids-PCR för virusdetektion: En reaktion på 25 μL kommer att förberedas för detektion av CMV genom RTPCR med användning av 10 μL extraherat DNA, 12,5 μL 2X PCR-buffert och 1,5 μL AgPath RT-PCR-reagenser (Thermo Fisher Scientific , Massachusetts USA) och 1 μL primer- och probsekvenser beskrivna på annat håll. Alla oligonukleotider kommer att syntetiseras och anskaffas från Thermo Fisher Scientific, USA, och termisk cykling kommer att utföras vid 95 °C i 3 minuter och sedan 40 cykler av 95 °C i 15 s, 58 °C för 30-talet med Applied bio system 7500 Realtids PCR-system (Thermo Fisher Scientific, Massachusetts USA). Varje test kommer att bestå av 5 kvantitativa kontroller och resultaten kommer att tolkas därefter.

Definitioner Akut nekrotiserande pankreatit: Detta kommer att diagnostiseras på grundval av kliniska tecken-symtom/laboratorieparametrar och närvaron av icke-förstärkande områden i bukspottkörteln vid en kontrastförstärkt CT-skanning (CECT).

CMV-reaktivering: Gränsvärdet för diagnos av CMV-reaktivering kommer att tas som ett värde på >1000 kopior/ml.

Datainsamling Demografiska och relevanta kliniska egenskaper hos inkluderade patienter kommer att samlas in på ett strukturerat fallrapportformulär.

Provstorlek och statistisk analys Bland screenad akut nekrotiserande pankreatit förväntas 95 % av patienterna ha seropositiva för IgG. Förutsatt att 50 % seropositiva (IgG) patienter kommer att utveckla Cytomegalovirus (CMV) reaktivering under intensivvårdsvistelsen. Om man tar en felmarginal på 15 % i den antagna prevalensen (dvs. förväntat intervall på 35 till 65 %), vid ett dubbelsidigt 95 % konfidensintervall är den uppskattade urvalsstorleken 43. Denna studie är tidsbegränsad och är 18 månader och så under studieperioden kommer alla berättigade patienter att screenas och övervägas för inkludering i denna studie. Utredarna väntar omkring 50 patienter.

Beskrivande statistik för de kontinuerliga variablerna ska presenteras som medel ± standardavvikelse/median (inter-kvartilintervall) medan kategoriska variabler i frekvens (%) som är lämpligt. Elevens t-test (oberoende såväl som t-test med parade sampel som är lämpligt) eller dess icke-parametriska metoder som ska användas för att jämföra medelvärden/medianerna mellan de två grupperna medan chi-kvadrattestet eller Fishers exakta test kommer att användas för att jämföra proportionerna. Incidensen av CMV-reaktiveringar kommer att beräknas och detta samband med demografiska och kliniska faktorer ska bedömas med univariata såväl som multivariata Cox proportionella riskmodeller. Ett p-värde < 0,05 anses vara statistiskt signifikant. Statistiskt paket för samhällsvetenskap, version-23 (SPSS-23, IBM, Chicago, USA), och MedCalc Software kommer att användas för dataanalys.