Riattivazione del CMV nella pancreatite necrotizzante acuta

Contesto e fondamento logico dello studio La pancreatite acuta è una delle malattie sistemiche riscontrate di frequente e si presenta con un ampio spettro di manifestazioni che vanno dalla malattia lieve che ha un esito migliore rispetto alla malattia grave che di solito porta al ricovero in unità di terapia intensiva (ICU), ed è associato ad alta mortalità. Secondo la classificazione rivista di Atlanta (2012), la pancreatite acuta è ora divisa in due distinti sottotipi, pancreatite necrotizzante e pancreatite edematosa interstiziale (IEP), in base alla presenza o assenza di necrosi. Nella pancreatite acuta grave, l'infiammazione porta a raccolte di liquido peri-pancreatico di cui vengono identificati quattro distinti sottotipi. Le raccolte necrotiche acute (ANC) e la necrosi murata (WON) che si verificano in pazienti con pancreatite necrotizzante, contengono quantità variabili di fluidi e detriti necrotici che possono essere sterili o infettivi. I tassi di mortalità per necrosi sterile rimangono relativamente bassi (5%-10%), ma la superinfezione del pancreas necrotico e delle raccolte di tessuto/liquido peri-pancreatico aumenta considerevolmente il tasso di mortalità (20%-30%).

Il necroso pancreatico infetto, se coltivato, di solito mostra flora monomicrobica nel 60-87% dei pazienti e flora polimicrobica nel 13-40% dei pazienti. I microrganismi isolati più comunemente sono batteri gram-negativi, principalmente Escherichia coli e Klebsiella pneumonia seguiti da batteri gram-positivi. Con l'aumento dell'uso di terapie antibiotiche in terapia intensiva, anche l'incidenza delle infezioni fungine pancreatiche è in aumento. Le infezioni pancreatiche fungine, prevalentemente causate da specie di Candida, sono state identificate in più della metà con una degenza ospedaliera più lunga e una sopravvivenza a un anno inferiore rispetto ai pazienti con sole infezioni pancreatiche batteriche.

Tradizionalmente, i pazienti critici sono stati considerati immunocompetenti, ma la presenza di sepsi e dei suoi effetti immunomodulatori può portare alla riattivazione di infezioni virali dormienti. Negli ultimi anni, la riattivazione del citomegalovirus (CMV) nei pazienti critici è stata riconosciuta con un'incidenza del 71%. La sepsi a causa dei suoi effetti immunomodulatori può portare alla riattivazione del CMV a causa del rilascio di citochine pro-infiammatorie come TNF-alfa e IL-1beta che ha la capacità di attivare diversi fattori di trascrizione che contribuiscono alla riattivazione del CMV. Gli studi hanno dimostrato che l'infezione da CMV nei pazienti in condizioni critiche era costantemente associata a risposte non rilevabili delle cellule T IFN-γ entro i primi 2 giorni dal ricovero in terapia intensiva e che la carica virale era inversamente correlata alle risposte delle cellule T IFN-γ. Risultati simili sono stati trovati in pazienti settici che mostrano paralisi del sistema immunitario, ridotta funzione delle cellule Th1, aumento della produzione di IL-10 (antinfiammatorio) e linfopenia globale che colpisce le cellule natural killer (NK) quantitativamente e qualitativamente correlate alla loro produzione di interferone.

Gli studi hanno documentato tassi di insufficienza d'organo e mortalità significativamente più elevati nei pazienti critici con riattivazione del CMV. In una revisione sistematica per indagare l'associazione tra la riattivazione del CMV e gli esiti clinici in pazienti immunocompetenti in condizioni critiche, inclusi gli studi Itwenty-two, la riattivazione del CMV è stata associata a un aumento della mortalità in UTI, della mortalità complessiva, della durata della ventilazione meccanica, delle infezioni nosocomiali e della durata della degenza in UTI. rimanere. La riattivazione del CMV è stata anche studiata in specifiche coorti di malati critici, mostrando il loro impatto sulla mortalità. È stato anche studiato l'effetto della riattivazione del CMV sulla mortalità nei pazienti con sindrome da distress respiratorio acuto (ARDS) immunocompetenti. Dei 399 pazienti con ARDS, il 68 % era sieropositivo per CMV e nel 27 % di essi si è verificata una riattivazione, che era associata a un aumento complessivo della mortalità in terapia intensiva. In un altro studio tra la coorte di shock settico (329 pazienti), le riattivazioni dell'herpesvirus sono state documentate nel 68% dei pazienti senza precedente immunodeficienza e hanno concluso che le riattivazioni potrebbero essere associate indipendentemente alla mortalità.

Tuttavia, non sono attualmente disponibili studi che indaghino sulla riattivazione del CMV in pazienti con pancreatite necrotizzante acuta (ANP). I ricercatori miravano a studiare la prevalenza della riattivazione del CMV e la sua cinetica della carica virale in pazienti critici con ANP

Obiettivi Studiare la prevalenza della riattivazione del citomegalovirus (CMV) e la sua cinetica della carica virale in pazienti adulti in condizioni critiche con pancreatite necrotizzante acuta

Metodologia Disegno dello studio Questo studio osservazionale prospettico sarà condotto presso il Dipartimento di Medicina Intensiva in collaborazione con il Dipartimento di Gastroenterologia e Microbiologia, SGPGIMS, Lucknow dopo l'approvazione del Comitato Etico Istituzionale (IEC).

Protocollo di studio Durante il periodo di studio, tutti i pazienti adulti in terapia intensiva con diagnosi di pancreatite necrotizzante acuta saranno presi in considerazione per l'inclusione. Secondo i criteri di inclusione ed esclusione, questi pazienti saranno sottoposti a screening per la presenza di anticorpi IgG anti CMV nel sangue. Se il paziente è sieropositivo per le IgG e soddisfa i criteri di inclusione/esclusione, verrà incluso nello studio e seguito per la riattivazione del CMV durante la degenza in terapia intensiva. Nei pazienti con riattivazione del CMV, la cinetica della carica virale sarà ulteriormente seguita per le prossime 2 settimane.

Raccolta dei campioni Campioni di sangue: 1,0 ml di sangue verrà raccolto in una fiala EDTA da un catetere venoso esistente, su base settimanale per trovare la riattivazione del CMV durante la loro permanenza in terapia intensiva o la decima settimana di malattia (a seconda di quale evento si verifichi per primo).

Drenaggio percutaneo: se il paziente aveva un drenaggio addominale in prossimità del pancreas, 2,0 ml verranno raccolti in un contenitore sterile su base settimanale per trovare la riattivazione del CMV durante la degenza in terapia intensiva o la decima settimana di malattia (a seconda di quale evento si verifichi per primo).

Necroso pancreatico: se il paziente è stato sottoposto a necrosectomia, il necroso pancreatico verrà raccolto in un contenitore sterile (una sola volta)

Analisi di laboratorio ELISA per il rilevamento degli anticorpi IgG: il siero raccolto sarà testato per gli anticorpi IgG mediante ELISA secondo le raccomandazioni del produttore. (Abbott Laboratories, Abbott Park, Illinois). Il cut-off sarà fissato a 0,5 WHO IU/ml (Calibratore 2) dal produttore del kit. I campioni con una concentrazione superiore a 0,5 WHO IU/ml saranno considerati positivi per CMV IgG. Tutti i campioni saranno testati in duplicato.

PCR quantitativa in tempo reale CMV:

Estrazione del DNA: L'estrazione del DNA verrà eseguita su 200 μl di un campione utilizzando un kit QIAamp DNA (Qiagen, Inc., Valencia, California). Quindi, verranno utilizzati 60 μl di Tris (10 mM, pH 8.0) per eluire il DNA e verranno utilizzati 10 μl del DNA per ogni PCR. Il DNA estratto sarà conservato a -800 C per ulteriori lavori.

PCR quantitativa in tempo reale per il rilevamento del virus: verrà preparata una reazione da 25 μL per il rilevamento di CMV mediante RTPCR utilizzando 10 μL di DNA estratto, 12,5 μL di tampone 2X PCR e 1,5 μL di reagenti AgPath RT-PCR (Thermo Fisher Scientific , Massachusetts USA) e 1 μL di sequenze di primer e sonda descritte altrove. Tutti gli oligonucleotidi saranno sintetizzati e acquistati da Thermo Fisher Scientific, USA, e il ciclo termico sarà eseguito a 95 °C per 3 min e poi 40 cicli di 95 °C per 15 s, 58 °C per 30 s utilizzando Applied bio system 7500 Sistema PCR in tempo reale (Thermo Fisher Scientific, Massachusetts USA). Ogni test sarà composto da 5 controlli quantitativi ei risultati saranno interpretati di conseguenza.

Definizioni Pancreatite acuta necrotizzante: sarà diagnosticata sulla base dei segni-sintomi clinici / parametri di laboratorio e della presenza di aree del pancreas non captanti alla TC con mezzo di contrasto (CECT).

Riattivazione di CMV: il cut-off per la diagnosi di riattivazione di CMV sarà assunto come valore >1000 copie/ml.

Raccolte di dati Le caratteristiche cliniche e demografiche rilevanti dei pazienti inclusi saranno raccolte su un modulo di case report strutturato.

Dimensione del campione e analisi statistica Tra le pancreatiti necrotizzanti acute sottoposte a screening, si prevede che il 95% dei pazienti sia sieropositivo per IgG. Supponendo che il 50% dei pazienti sieropositivi (IgG) svilupperà la riattivazione del citomegalovirus (CMV) durante la degenza in terapia intensiva. Prendendo un margine di errore del 15% nella presunta prevalenza (es. intervallo previsto dal 35 al 65%), a un intervallo di confidenza bilaterale del 95%, la dimensione stimata del campione è 43. Questo studio è limitato nel tempo è di 18 mesi e quindi durante il periodo di studio tutti i pazienti idonei saranno sottoposti a screening e presi in considerazione per l'inclusione in questo studio. Gli investigatori si aspettano circa 50 pazienti.

Le statistiche descrittive delle variabili continue devono essere presentate come media ± deviazione standard/mediana (intervallo interquartile) mentre le variabili categoriali in frequenza (%) a seconda dei casi. Il test t di Student (test t per campioni indipendenti e accoppiati a seconda dei casi) o i suoi metodi non parametrici da utilizzare per confrontare le medie/mediane tra i due gruppi mentre verrà utilizzato il test Chi-quadro o il test esatto di Fisher per confrontare le proporzioni. L'incidenza delle riattivazioni di CMV sarà calcolata e questa associazione con fattori demografici e clinici sarà valutata utilizzando modelli di rischio proporzionale di Cox univariati e multivariati. Un p-value <0,05 sarà considerato statisticamente significativo. Il pacchetto statistico per le scienze sociali, versione 23 (SPSS-23, IBM, Chicago, USA) e il software MedCalc verranno utilizzati per l'analisi dei dati.