Reativação do CMV na Pancreatite Necrosante Aguda

Antecedentes e Justificativa do Estudo A pancreatite aguda é uma das doenças sistêmicas frequentemente encontradas, apresentando um amplo espectro de apresentação, variando de doença leve, que tem um resultado melhor em comparação com doença grave, que geralmente leva à internação na unidade de terapia intensiva (UTI), e está associada a alta mortalidade. De acordo com a classificação revisada de Atlanta (2012), a pancreatite aguda agora é dividida em dois subtipos distintos, pancreatite necrosante e pancreatite edematosa intersticial (IEP), com base na presença ou ausência de necrose. Na pancreatite aguda grave, a inflamação leva a acúmulos de líquido peripancreático, dos quais quatro subtipos distintos são identificados. Coleções necróticas agudas (ANC) e necrose isolada (WON) que ocorrem em pacientes com pancreatite necrosante, contêm quantidades variáveis ​​de fluido e detritos necróticos que podem ser estéreis ou infecciosos. As taxas de mortalidade por necrose estéril permanecem comparativamente baixas (5%-10%), mas a superinfecção do pâncreas necrótico e coleções de fluidos/tecido peripancreático aumenta consideravelmente a taxa de mortalidade (20%-30%).

O necroso pancreático infectado, quando cultivado, geralmente demonstra flora monomicrobiana em 60-87% dos pacientes e flora polimicrobiana em 13-40% dos pacientes. Os organismos mais comumente isolados são bactérias gram-negativas, principalmente Escherichia coli e Klebsiella pneumonia, seguidas por bactérias gram-positivas. Com o aumento do uso de terapias antibióticas na UTI, a incidência de infecções fúngicas pancreáticas também está aumentando. Infecções pancreáticas fúngicas, predominantemente causadas por espécies de Candida, foram identificadas em até metade com internação hospitalar mais longa e sobrevida de um ano menor do que pacientes com infecções pancreáticas bacterianas apenas.

Tradicionalmente, pacientes críticos são considerados imunocompetentes, mas a presença de sepse e seus efeitos imunomoduladores podem levar à reativação de infecções virais latentes. Nos últimos anos, a reativação do citomegalovírus (CMV) em pacientes críticos foi reconhecida com uma incidência de até 71%. A sepse por seus efeitos imunomoduladores pode levar à reativação do CMV devido à liberação de citocinas pró-inflamatórias como TNF-alfa e IL-1beta que tem a capacidade de ativar diversos fatores de transcrição que contribuem para a reativação do CMV. Estudos mostraram que a infecção por CMV em pacientes críticos foi consistentemente associada a respostas indetectáveis ​​de células T IFN-γ nos primeiros 2 dias de internação na UTI e que a carga viral foi inversamente relacionada às respostas de células T IFN-γ. Resultados semelhantes foram encontrados em pacientes sépticos que apresentam paralisia do sistema imunológico, redução da função das células Th1, aumento da produção de IL-10 (anti-inflamatório) e linfopenia global afetando as células natural killer (NK) quantitativa e qualitativamente relacionadas à sua produção de interferon.

Estudos documentaram taxas significativamente mais altas de falência de órgãos e mortalidade em pacientes gravemente enfermos com reativação de CMV. Em uma revisão sistemática para investigar a associação entre a reativação do CMV e os resultados clínicos em pacientes críticos imunocompetentes, incluindo estudos Itwenty-two, a reativação do CMV foi associada ao aumento da mortalidade na UTI, mortalidade geral, duração da ventilação mecânica, infecções nosocomiais e tempo de internação na UTI. ficar. A reativação do CMV também foi estudada em coortes específicas de doentes críticos, exibindo seu impacto na mortalidade. O efeito da reativação do CMV na mortalidade em pacientes imunocompetentes com síndrome do desconforto respiratório agudo (SDRA) também foi estudado. Dos 399 pacientes com SDRA, 68% eram soropositivos para CMV e a reativação ocorreu em 27% deles, o que foi associado ao aumento geral da mortalidade na UTI. Em outro estudo entre a coorte de choque séptico (329 pacientes), as reativações do herpesvírus foram documentadas em 68% dos pacientes sem imunodeficiência prévia e concluíram que as reativações poderiam estar associadas de forma independente à mortalidade.

No entanto, atualmente não há estudos disponíveis investigando a reativação do CMV em pacientes com pancreatite aguda necrosante (PNA). Os investigadores tiveram como objetivo estudar a prevalência da reativação do CMV e sua cinética de carga viral em pacientes críticos com PNA

Objetivos Estudar a prevalência da reativação do Citomegalovírus (CMV) e sua cinética de carga viral em pacientes adultos críticos com pancreatite aguda necrotizante

Metodologia Desenho do estudo Este estudo observacional prospectivo será realizado no Departamento de Medicina Intensiva em colaboração com o Departamento de Gastroenterologia e Microbiologia, SGPGIMS, Lucknow após aprovação do Comitê de Ética Institucional (IEC).

Protocolo do estudo Durante o período do estudo, todos os pacientes adultos de UTI com diagnóstico de pancreatite aguda necrosante serão considerados para inclusão. De acordo com os critérios de inclusão e exclusão, esses pacientes serão rastreados quanto à presença de anticorpos anti-CMV IgG no sangue. Se o paciente for soropositivo para IgG e atender aos critérios de inclusão/exclusão, ele será incluído no estudo e acompanhado para reativação do CMV durante a internação na UTI. Em pacientes com reativação de CMV, a cinética da carga viral será acompanhada nas próximas 2 semanas.

Coleta de amostras Amostras de sangue: 1,0 ml de sangue serão coletados em um frasco de EDTA de um cateter venoso existente, semanalmente para encontrar a reativação do CMV durante a internação na UTI ou 10ª semana de doença (o que ocorrer primeiro).

Dreno percutâneo: Se o paciente tiver um dreno abdominal nas proximidades do pâncreas, 2,0 ml serão coletados em um recipiente estéril semanalmente para encontrar a reativação do CMV durante a internação na UTI ou na 10ª semana de doença (o que ocorrer primeiro).

Necroso pancreático: Se o paciente foi submetido a necrosectomia, o necroso pancreático será coletado em um recipiente estéril (tempo único)

Análise laboratorial ELISA para detecção de anticorpos IgG: O soro coletado será testado para anticorpos IgG por ELISA conforme recomendações do fabricante. (Laboratórios Abbott, Abbott Park, IL). O limite será definido em 0,5 WHO IU/ml (Calibrador 2) pelo fabricante do kit. Amostras com concentração superior a 0,5 WHO UI/ml serão consideradas positivas para CMV IgG. Todas as amostras serão testadas em duplicado.

PCR quantitativo em tempo real de CMV:

Extração de DNA: A extração de DNA será realizada em 200 μl de uma amostra usando um kit QIAamp DNA (Qiagen, Inc., Valencia, Calif.). Em seguida, serão utilizados 60 μl de Tris (10 mM, pH 8,0) para eluir o DNA, e 10 μl do DNA serão utilizados para cada PCR. O DNA extraído será armazenado a -800 C para posterior trabalho.

PCR Quantitativo em Tempo Real para detecção do vírus: Uma reação de 25 μL será preparada para a detecção de CMV por RTPCR utilizando 10 μL de DNA extraído, 12,5 μL de tampão 2X PCR e 1,5 μL de AgPath RT-PCR Reagents (Thermo Fisher Scientific , Massachusetts, EUA) e 1 μL de sequências de primer e sonda descritas em outro lugar. Todos os oligonucleotídeos serão sintetizados e adquiridos da Thermo Fisher Scientific, EUA, e a ciclagem térmica será realizada a 95 °C por 3 min e, em seguida, 40 ciclos de 95 °C por 15 s, 58 °C por 30 s usando Applied bio system 7500 Sistema de PCR em tempo real (Thermo Fisher Scientific, Massachusetts, EUA). Cada teste consistirá em 5 controles quantitativos e os resultados serão interpretados de acordo.

Definições Pancreatite necrosante aguda: será diagnosticada com base nos sinais-sintomas clínicos/parâmetros laboratoriais e na presença de áreas sem realce do pâncreas em uma tomografia computadorizada com contraste (CECT).

Reativação do CMV: O valor limite para o diagnóstico da reativação do CMV será >1000 cópias/ml.

Coleta de dados As características demográficas e clínicas relevantes dos pacientes incluídos serão coletadas em um formulário de relato de caso estruturado.

Tamanho da amostra e análise estatística Entre pancreatite necrosante aguda rastreada, espera-se que 95% dos pacientes sejam soropositivos para IgG. Assumindo que 50% dos pacientes soropositivos (IgG) desenvolverão reativação do citomegalovírus (CMV) durante a internação na UTI. Tomando uma margem de erro de 15% na prevalência assumida (ou seja, intervalo esperado de 35 a 65%), em um intervalo de confiança bilateral de 95%, o tamanho estimado da amostra é 43. Este estudo tem um limite de tempo de 18 meses e, portanto, durante o período do estudo, todos os pacientes elegíveis serão selecionados e considerados para inclusão neste estudo. Os investigadores estão esperando cerca de 50 pacientes.

As estatísticas descritivas das variáveis ​​contínuas devem ser apresentadas como média±desvio padrão/mediana (faixa interquartil), enquanto as variáveis ​​categóricas em frequência (%) conforme apropriado. O teste t de Student (independente, bem como o teste t de amostras pareadas, conforme apropriado) ou seus métodos não paramétricos a serem usados ​​para comparar as médias/medianas entre os dois grupos, enquanto o teste qui-quadrado ou o teste exato de Fisher serão usados para comparar as proporções. As incidências de reativações de CMV serão calculadas e essa associação com fatores demográficos e clínicos será avaliada usando modelos de risco proporcional de Cox univariados e multivariados. Um valor de p < 0,05 será considerado estatisticamente significativo. O pacote estatístico para ciências sociais, versão 23 (SPSS-23, IBM, Chicago, EUA) e o Software MedCalc serão utilizados para a análise dos dados.