Reaktywacja CMV w ostrym martwiczym zapaleniu trzustki

Tło i uzasadnienie badania Ostre zapalenie trzustki jest jedną z często spotykanych chorób ogólnoustrojowych, charakteryzującą się szerokim spektrum objawów, od łagodnej choroby, która daje lepsze rokowanie w porównaniu do ciężkiej choroby, która zwykle prowadzi do przyjęcia na oddział intensywnej terapii (OIT), i wiąże się z dużą śmiertelnością. Zgodnie z poprawioną klasyfikacją z Atlanty (2012), ostre zapalenie trzustki dzieli się obecnie na dwa odrębne podtypy, martwicze zapalenie trzustki i śródmiąższowe obrzękowe zapalenie trzustki (IEP), na podstawie obecności lub braku martwicy. W ciężkim ostrym zapaleniu trzustki stan zapalny prowadzi do gromadzenia się płynów okołotrzustkowych, z których zidentyfikowano cztery różne podtypy. Ostre ogniska martwicze (ANC) i martwica otoczona ścianą (WON), które występują u pacjentów z martwiczym zapaleniem trzustki, zawierają różne ilości płynu i nekrotycznych resztek, które mogą być jałowe lub zakaźne. Śmiertelność z powodu jałowej martwicy pozostaje stosunkowo niska (5%-10%), ale nadkażenie martwiczej trzustki i tkanek/płynów okołotrzustkowych znacznie zwiększa śmiertelność (20%-30%).

Zakażona martwica trzustki po hodowli zwykle wykazuje florę jednodrobnoustrojową u 60-87% pacjentów i florę wielodrobnoustrojową u 13-40% pacjentów. Najczęściej izolowanymi organizmami są bakterie Gram-ujemne, głównie Escherichia coli i Klebsiella pneumoniae, a następnie bakterie Gram-dodatnie. Wraz ze wzrostem stosowania antybiotykoterapii na OIT rośnie również częstość występowania zakażeń grzybiczych trzustki. Zakażenia grzybicze trzustki, głównie wywołane przez gatunki Candida, zostały zidentyfikowane w połowie z dłuższym pobytem w szpitalu i krótszym rocznym przeżyciem niż u pacjentów z samymi bakteryjnymi zakażeniami trzustki.

Tradycyjnie pacjentów w stanie krytycznym uważano za immunokompetentnych, ale obecność posocznicy i jej działanie immunomodulujące może prowadzić do reaktywacji uśpionych infekcji wirusowych. W ostatnich latach stwierdzono reaktywację wirusa cytomegalii (CMV) u pacjentów w stanie krytycznym z częstością sięgającą 71%. Sepsa ze względu na działanie immunomodulujące może prowadzić do reaktywacji CMV w wyniku uwalniania cytokin prozapalnych, takich jak TNF-alfa i IL-1beta, które mają zdolność aktywacji kilku czynników transkrypcyjnych przyczyniających się do reaktywacji CMV. Badania wykazały, że zakażenie CMV u pacjentów w stanie krytycznym było konsekwentnie związane z niewykrywalnymi odpowiedziami limfocytów T IFN-γ w ciągu pierwszych 2 dni przyjęcia na OIOM, a miano wirusa było odwrotnie proporcjonalne do odpowiedzi limfocytów T IFN-γ. Podobne wyniki uzyskano u pacjentów z sepsą, u których występuje paraliż układu odpornościowego, zmniejszona funkcja limfocytów Th1, zwiększona produkcja IL-10 (działająca przeciwzapalnie) i globalna limfopenia wpływająca na komórki NK (ang. natural killer cells, NK) ilościowo i jakościowo związana z produkcją interferonu.

Badania udokumentowały znacznie wyższe wskaźniki niewydolności narządów i śmiertelności u krytycznie chorych pacjentów z reaktywacją CMV. W przeglądzie systematycznym mającym na celu zbadanie związku między reaktywacją CMV a wynikami klinicznymi u krytycznie chorych pacjentów z prawidłową czynnością układu odpornościowego, w tym w badaniach Itwenty Two, reaktywacja CMV była związana ze zwiększoną śmiertelnością na OIT, śmiertelnością ogólną, czasem trwania wentylacji mechanicznej, zakażeniami szpitalnymi i długością pobytu na OIT zostawać. Reaktywację CMV badano również w określonych krytycznie chorych kohortach, wykazując ich wpływ na śmiertelność. Zbadano również wpływ reaktywacji wirusa CMV na śmiertelność pacjentów z zespołem ostrej niewydolności oddechowej (ARDS) z prawidłową odpornością. Spośród 399 pacjentów z ARDS 68% było seropozytywnych w kierunku CMV, a reaktywacja wystąpiła u 27% z nich, co wiązało się z ogólną zwiększoną śmiertelnością na OIT. W innym badaniu wśród kohorty wstrząsu septycznego (329 pacjentów) udokumentowano reaktywację wirusa opryszczki u 68% pacjentów bez wcześniejszego niedoboru odporności i stwierdzono, że reaktywacje mogą być niezależnie związane ze śmiertelnością.

Jednak obecnie nie są dostępne żadne badania oceniające reaktywację CMV u pacjentów z ostrym martwiczym zapaleniem trzustki (ANP). Celem badaczy było zbadanie częstości reaktywacji CMV i kinetyki miana wirusa u krytycznie chorych pacjentów z ANP

Cele Badanie częstości reaktywacji wirusa cytomegalii (CMV) i kinetyki jego miana wirusa u krytycznie chorych dorosłych pacjentów z ostrym martwiczym zapaleniem trzustki

Metodologia Projekt badania To prospektywne badanie obserwacyjne zostanie przeprowadzone na Wydziale Medycyny Intensywnej Terapii we współpracy z Oddziałem Gastroenterologii i Mikrobiologii, SGPGIMS, Lucknow, po zatwierdzeniu przez Institutional Ethics Committee (IEC).

Protokół badania W okresie badania wszyscy dorośli pacjenci przebywający na OIT z rozpoznaniem ostrego martwiczego zapalenia trzustki będą brani pod uwagę do włączenia. Zgodnie z kryteriami włączenia i wyłączenia, pacjenci ci zostaną poddani badaniu przesiewowemu na obecność przeciwciał anty-CMV IgG we krwi. Jeśli pacjent jest seropozytywny IgG i spełnia kryteria włączenia/wyłączenia, zostanie włączony do badania i poddany obserwacji pod kątem reaktywacji CMV podczas pobytu na OIT. U pacjentów z reaktywacją CMV kinetyka miana wirusa będzie dalej monitorowana przez następne 2 tygodnie.

Pobieranie próbek Próbki krwi: 1,0 ml krwi będzie pobierane do fiolki z EDTA z istniejącego cewnika żylnego co tydzień w celu wykrycia reaktywacji CMV podczas pobytu na OIT lub 10. tygodniu choroby (w zależności od tego, co nastąpi wcześniej).

Drenaż przezskórny: Jeśli pacjent miał drenaż brzuszny w pobliżu trzustki, 2,0 ml będzie pobierane co tydzień do sterylnego pojemnika w celu wykrycia reaktywacji CMV podczas pobytu na OIT lub w 10. tygodniu choroby (w zależności od tego, co nastąpi wcześniej).

Martwica trzustki: Jeśli pacjent był poddawany nekrosektomii, wówczas martwica trzustki zostanie pobrana do sterylnego pojemnika (jednorazowo)

Analiza laboratoryjna ELISA w celu wykrycia przeciwciał IgG: Pobrana surowica zostanie zbadana na obecność przeciwciał IgG za pomocą testu ELISA zgodnie z zaleceniami producenta. (Abbott Laboratories, Abbott Park, Illinois). Wartość odcięcia zostanie ustawiona przez producenta zestawu na 0,5 IU WHO/ml (kalibrator 2). Próbki o stężeniu wyższym niż 0,5 j.m. WHO/ml będą uważane za dodatnie w kierunku CMV IgG. Wszystkie próbki zostaną przetestowane w dwóch powtórzeniach.

Ilościowa PCR w czasie rzeczywistym CMV:

Ekstrakcja DNA: Ekstrakcja DNA zostanie przeprowadzona na 200 μl próbki przy użyciu zestawu QIAamp DNA (Qiagen, Inc., Valencia, Kalifornia). Następnie 60 μl Tris (10 mM, pH 8,0) zostanie użyte do wymycia DNA, a 10 μl DNA zostanie użyte do każdego PCR. Wyekstrahowany DNA będzie przechowywany w temperaturze -800 C do dalszych prac.

Ilościowa PCR w czasie rzeczywistym w celu wykrycia wirusa: 25 μl reakcji zostanie przygotowane do wykrycia CMV metodą RTPCR z wykorzystaniem 10 μl wyekstrahowanego DNA, 12,5 μl 2X buforu do PCR i 1,5 μl odczynników AgPath RT-PCR (Thermo Fisher Scientific , Massachusetts USA) i 1 μl sekwencji startera i sondy opisanych gdzie indziej. Wszystkie oligonukleotydy zostaną zsyntetyzowane i zakupione w firmie Thermo Fisher Scientific, USA, a cykle termiczne zostaną przeprowadzone w temperaturze 95°C przez 3 min, a następnie 40 cykli w temperaturze 95°C przez 15 s, 58°C przez 30 s przy użyciu Applied bio system 7500 System PCR w czasie rzeczywistym (Thermo Fisher Scientific, Massachusetts USA). Każdy test będzie składał się z 5 kontroli ilościowych, a wyniki będą odpowiednio interpretowane.

Definicje Ostre martwicze zapalenie trzustki: zostanie rozpoznane na podstawie objawów klinicznych/parametrów laboratoryjnych oraz obecności niewzmacniających się obszarów trzustki w tomografii komputerowej ze wzmocnieniem kontrastowym (CECT).

Reaktywacja CMV: Punkt odcięcia dla rozpoznania reaktywacji CMV zostanie przyjęty jako wartość >1000 kopii/ml.

Zbieranie danych Demograficzne i istotne cechy kliniczne włączonych pacjentów zostaną zebrane w ustrukturyzowanym formularzu opisu przypadku.

Wielkość próby i analiza statystyczna Oczekuje się, że wśród przebadanych ostrych martwiczych zapaleń trzustki 95% pacjentów będzie seropozytywnych w kierunku IgG. Zakładając, że u 50% pacjentów seropozytywnych (IgG) dojdzie do reaktywacji wirusa cytomegalii (CMV) podczas pobytu na OIT. Przyjęcie 15% marginesu błędu w zakładanym rozpowszechnieniu (tj. oczekiwany zakres od 35 do 65%), przy dwustronnym 95% przedziale ufności, szacowana wielkość próby wynosi 43. To badanie jest ograniczone czasowo do 18 miesięcy, więc w okresie badania wszyscy kwalifikujący się pacjenci zostaną przebadani i rozważeni w celu włączenia do tego badania. Badacze spodziewają się około 50 pacjentów.

Statystyki opisowe zmiennych ciągłych należy przedstawić jako średnią ± odchylenie standardowe/medianę (rozstęp międzykwartylowy), natomiast zmienne kategoryczne odpowiednio w częstości (%). Test t-Studenta (odpowiednio test niezależny lub test t dla par) lub jego metody nieparametryczne do porównania średnich/median między dwiema grupami, podczas gdy zastosowany zostanie test chi-kwadrat lub dokładny test Fishera porównać proporcje. Częstość występowania reaktywacji CMV zostanie obliczona, a związek z czynnikami demograficznymi i klinicznymi zostanie oceniony za pomocą jednowymiarowych i wielowymiarowych modeli proporcjonalnego ryzyka Coxa. Wartość p < 0,05 zostanie uznana za istotną statystycznie. Do analizy danych zostanie wykorzystany pakiet statystyczny dla nauk społecznych, wersja 23 (SPSS-23, IBM, Chicago, USA) oraz oprogramowanie MedCalc.