急性坏死性胰腺炎中的 CMV 再激活

研究的背景和基本原理 急性胰腺炎是一种常见的全身性疾病，其表现范围很广，从预后较好的轻度疾病到通常导致入住重症监护病房 (ICU) 的严重疾病，并且与高死亡率有关。 根据修订后的亚特兰大分类 (2012)，急性胰腺炎现在根据坏死的存在与否分为两种不同的亚型，即坏死性胰腺炎和间质性水肿性胰腺炎 (IEP)。 在重症急性胰腺炎中，炎症导致胰周积液，其中鉴定出四种不同的亚型。 发生在坏死性胰腺炎患者中的急性坏死性积液 (ANC) 和包壁性坏死 (WON) 含有不同数量的液体和坏死碎片，这些碎片可以是无菌的或感染性的。 无菌性坏死的死亡率仍然相对较低 (5%-10%)，但坏死胰腺和胰腺周围组织/液体收集的重叠感染会大大增加死亡率 (20%-30%)。

培养时感染的胰腺坏死通常在 60-87% 的患者中显示单一微生物菌群，在 13-40% 的患者中显示多微生物菌群。 分离出的最常见生物体是革兰氏阴性菌，主要是大肠杆菌和肺炎克雷伯菌，其次是革兰氏阳性菌。 随着 ICU 中抗生素疗法的使用增加，胰腺真菌感染的发病率也在上升。 真菌性胰腺感染主要由念珠菌引起，与仅患有细菌性胰腺感染的患者相比，已发现多达一半的患者住院时间更长，一年生存率更低。

传统上，危重病人被认为具有免疫能力，但脓毒症的存在及其免疫调节作用可能导致休眠病毒感染的重新激活。 近年来，重症患者的巨细胞病毒 (CMV) 再激活的发生率高达 71%。 脓毒症由于其免疫调节作用可能导致 CMV 再激活，这是由于促炎细胞因子如 TNF-α 和 IL-1beta 的释放，这些细胞因子具有激活多种有助于 CMV 再激活的转录因子的能力。 研究表明，重症患者的 CMV 感染与入住 ICU 的前 2 天内无法检测到的 IFN-γ T 细胞反应始终相关，并且病毒载量与 IFN-γ T 细胞反应呈负相关。 在表现出免疫系统麻痹、Th1 细胞功能降低、IL-10 生成增加（抗炎）以及影响自然杀伤细胞 (NK) 的全身淋巴细胞减少症中，也发现了类似的结果，这些患者在数量和质量上都与干扰素的生成有关。

研究表明，CMV 再激活的危重患者的器官衰竭率和死亡率明显更高。 在一项旨在调查 CMV 再激活与免疫功能正常的危重患者临床结果之间关联的系统评价中，包括 22 项研究，CMV 再激活与 ICU 死亡率、总死亡率、机械通气持续时间、院内感染和 ICU 住院时间增加有关停留。 CMV 再激活也在特定的重症患者队列中进行了研究，展示了它们对死亡率的影响。 还研究了 CMV 再激活对免疫活性急性呼吸窘迫综合征 (ARDS) 患者死亡率的影响。 在 399 名 ARDS 患者中，68% 为 CMV 血清反应阳性，其中 27% 发生再激活，这与 ICU 死亡率的总体增加有关。 在针对感染性休克队列（329 名患者）的另一项研究中，68% 的既往无免疫缺陷的患者记录到疱疹病毒再激活，并得出结论认为再激活可能与死亡率独立相关。

然而，目前没有研究调查急性坏死性胰腺炎 (ANP) 患者的 CMV 再激活。 研究人员旨在研究 ANP 危重患者中 CMV 再激活的发生率及其病毒载量动力学

目的 研究成人急性坏死性胰腺炎危重患者巨细胞病毒 (CMV) 再激活的发生率及其病毒载量动力学

方法学 研究设计 在获得机构伦理委员会 (IEC) 的批准后，这项前瞻性观察研究将与勒克瑙 SGPGIMS 的胃肠病学和微生物学系合作在重症监护医学系进行。

研究方案 在研究期间，将考虑纳入所有诊断为急性坏死性胰腺炎的成年 ICU 患者。 根据纳入和排除标准，将对这些患者的血液中是否存在抗 CMV IgG 抗体进行筛查。 如果患者是 IgG 血清反应阳性并符合纳入/排除标准，则他们将被纳入研究，并在他们入住 ICU 期间对 CMV 再激活进行随访。 在有 CMV 再激活的患者中，将在接下来的 2 周内进一步跟踪病毒载量动力学。

样本采集 血液样本：每周从现有的静脉导管中收集 1.0 毫升血液到 EDTA 小瓶中，以在他们入住 ICU 或患病第 10 周（以先到者为准）期间发现 CMV 再激活。

经皮引流：如果患者在胰腺附近进行了腹腔引流，则每周在无菌容器中收集 2.0 毫升，以在他们入住 ICU 期间或患病第 10 周（以先到者为准）发现 CMV 再激活。

胰腺坏死：如果患者接受了坏死切除术，那么胰腺坏死将收集在无菌容器中（单次）

用于 IgG 抗体检测的实验室分析 ELISA：收集的血清将根据制造商的建议通过 ELISA 检测 IgG 抗体。 （雅培实验室，雅培公园，伊利诺伊州）。 试剂盒制造商将 的截止值设置为 0.5 WHO IU/ml（校准器 2）。 浓度高于 0.5 WHO IU/ml 的样品将被视为 CMV IgG 阳性。 所有样品将一式两份进行测试。

CMV 定量实时 PCR：

DNA 提取：将使用 QIAamp DNA 试剂盒（Qiagen, Inc., Valencia, CA）对 200 μl 样品进行 DNA 提取。 然后，将使用 60 μl Tris（10 mM，pH 8.0）洗脱 DNA，每次 PCR 将使用 10 μl DNA。 提取的 DNA 将储存在 -800 C 以备进一步使用。

用于病毒检测的定量实时 PCR：将使用 10 μL 提取的 DNA、12.5 μL 2X PCR 缓冲液和 1.5 μL AgPath RT-PCR 试剂（Thermo Fisher Scientific）准备 25 μL 反应以通过 RTPCR 检测 CMV , Massachusetts USA) 和其他地方描述的 1 μL 引物和探针序列。 所有寡核苷酸均由美国Thermo Fisher Scientific合成采购，采用Applied bio system 7500热循环95℃3分钟，95℃15秒，58℃30秒40个循环实时 PCR 系统（Thermo Fisher Scientific，美国马萨诸塞州）。 每个测试将由 5 个定量控制组成，结果将被相应地解释。

定义 急性坏死性胰腺炎：这将根据临床体征-症状/实验室参数和对比增强 CT (CECT) 扫描中胰腺非增强区域的存在进行诊断。

CMV 再激活：诊断 CMV 再激活的截止值将被视为 >1000 拷贝/ml 的值。

数据收集 纳入患者的人口统计学和相关临床特征将收集在结构化病例报告表中。

样本量和统计分析 在筛查的急性坏死性胰腺炎患者中，预计 95% 的患者 IgG 血清阳性。 假设 50% 的血清阳性 (IgG) 患者在 ICU 停留期间会出现巨细胞病毒 (CMV) 再激活。 假设流行率有 15% 的误差（即 预期范围为 35 至 65%)，在双侧 95% 置信区间，估计样本量为 43。 该研究的时间限制为 18 个月，因此在研究期间将筛选所有符合条件的患者并考虑纳入该研究。 研究人员预计约有 50 名患者。

连续变量的描述性统计数据将以平均值±标准偏差/中值（四分位数间距）的形式呈现，而分类变量则以频率（%）为准。 学生 t 检验（独立以及配对样本 t 检验，视情况而定）或其非参数方法用于比较两组之间的均值/中位数，而将使用卡方检验或 Fisher 精确检验来比较比例。 将计算 CMV 再激活的发生率，并使用单变量和多变量 Cox 比例风险模型评估这种与人口统计学和临床​​因素的关联。 p 值 < 0.05 将被视为具有统计学意义。 社会科学统计软件包，第 23 版（SPSS-23，IBM，芝加哥，美国）和 MedCalc 软件将用于数据分析。