VYŠETŘENÍ VYJÁDŘENÍ HLADIN CTXI VE SLINÁCH PŘI BRZNÉM a ZPOŽDĚNÉM ZATÍŽENÍ ZUBNÍCH IMPLANTÁTŮ

Do studie bude přijato 40 pacientů přicházejících na OPD Dow International Dental College za účelem umístění implantátu do zadní dolní čelisti (molární oblast).

Pacientům budou umístěny zubní implantáty dostupné v ambulanci (OPD) Dow International Dental College (DIDC). Zubní implantáty budou umístěny podle standardních protokolů Dr. Shaheen Ahmed.

Pacienti budou rozděleni do dvou skupin. Pacienti skupiny A budou včasně zatíženi a skupina B bude konvenčně zatížena protézou.

U každého pacienta bude po operaci po 1 měsíci, 2 měsících a 3 měsících pomocí Periotestu hodnocena stabilita implantátu.

Sliny budou odebírány pacientům v obou skupinách před zavedením implantátu a ve stejných dnech jako hodnocení Periotest po operaci. Sliny budou zpracovány a okamžitě skladovány při -80oC. Později bude provedena sendvičová ELISA pro expresní analýzu CTX.

Hladiny CTX před operací implantátu budou v této studii sloužit jako referenční hodnota.

2.9.1 Metoda odběru slin:

Z obou studijních skupin budou odebrány celé nestimulované sliny (WUS). Proces sběru slin je následující:

• Vzorky slin budou odebírány mezi 9-11 hodinou ráno, aby se minimalizovaly denní odchylky v toku slin a změny v chemii siala.
• Pacienti budou požádáni, aby se zdrželi kouření, pití a žvýkání nejméně jednu hodinu před odběrem slin, aby se zabránilo interferenci vody a potravy s analýzou.
• K odstranění zbytků potravy z úst budou pacienti požádáni, aby si před odběrem slin vypláchli ústa vodou.
• Po důkladném opláchnutí bude před odběrem vzorků slin dán interval alespoň 10 minut, aby nedošlo k naředění vzorku.
• Pacienti budou požádáni, aby vyplivli sliny do sterilizované zkumavky Falcon o objemu 15 ml.
• Od každého pacienta bude odebráno přibližně 2-5 ml slin.
• Pacient bude informován a bude mu řečeno, aby nevykašlával hlen.
• Po odběru slin budou vzorky ihned odvezeny do laboratoře k dalšímu zpracování.
• Vzorky slin budou centrifugovány při 8000 ot./min. po dobu 15 minut při 4˚C, aby se odstranily veškeré zbytky buněk a supernatant bude odebrán.
• Odebraný supernatant bude rozdělen do alikvotů do mikrozkumavek o objemu 1 ml a bude uchováván při -80 °C až do další analýzy (doba zpracování slin bude co nejnižší).

2.9.2 Analýza slin:

Enzyme Linked Immunosorbent Assay (sendvičová technika):

Hladiny CTX ve vzorcích slin všech skupin budou analyzovány technikou sendvičové ELISA (Enzyme Linked Immunosorbent Assay). Testování ELISA bude provedeno pomocí soupravy CTX podle pokynů výrobce. Destička předem potažená protilátkou specifickou pro lidský CTX bude dodána se soupravou. Standardy nebo vzorky se přidávají do jamek mikro ELISA destičky, což umožňuje CTX vázat se na jeho specifickou protilátku. Po odstranění nenavázaného vzorku se přidá biotinylovaná detekční protilátka CTX s následným promytím pufrem. Po promytí bude destička inkubována se streptavidin-křenovou peroxidázou (HRP), která se naváže na detekční protilátku. Po inkubaci se nenavázaný Streptavidin-HRP smyje. Nakonec se přidá roztok substrátu. Intenzita vyvinuté barvy je úměrná množství lidského CTX přítomného ve vzorku. Reakce bude zastavena přidáním stop roztoku a absorbance bude měřena spektrofotometricky při vlnové délce 450 nm. Koncentrace CTX ve vzorcích se získá porovnáním absorbance vzorků se standardy.

ELISA bude provedena hlavní řešitelkou studie s pomocí jejího spoluškolitele v DRIBBS (Dow Research Institute of Biotechnology and Biomedical Sciences).