UNDERSØKELSE av UTTRYKK av CTXI-NIVÅER I SPYTT MED TIDLIG og FORSINKET LASTING AV DENTALIMPLANTATER

40 pasienter som kommer til OPD ved Dow International Dental College for implantatplassering i bakre mandible (molar område) vil bli rekruttert i studien.

Tannimplantater tilgjengelig i poliklinisk avdeling (OPD) ved Dow International Dental College (DIDC) vil bli plassert i pasienter. Tannimplantater vil bli plassert i henhold til standardprotokollene av Dr. Shaheen Ahmed.

Pasientene vil bli delt inn i to grupper. Gruppe A-pasienter vil bli tidlig belastet, og gruppe B vil bli konvensjonelt belastet med protese.

Hver pasient vil bli evaluert for implantatstabilitet etter operasjonen, etter 1 måned, 2 måneder og 3 måneder ved hjelp av Periotest.

Spytt vil bli samlet inn fra pasienter i begge gruppene før innsetting av implantat og på samme dager som for Periotest-evalueringer etter operasjonen. Spytt vil bli behandlet og umiddelbart lagret ved -80oC. Senere sandwich ELISA vil bli utført for ekspresjonsanalyse av CTX.

Nivåer av CTX før implantatkirurgi vil bli tjent som referanseverdi i denne studien.

2.9.1 Spyttoppsamlingsmetode:

Helt ustimulert spytt (WUS) vil bli samlet inn fra begge studiegruppene. Prosessen med spyttoppsamling er som følger:

• Spyttprøver vil bli samlet inn mellom kl. 9-11 for å minimere daglige variasjoner i spyttstrøm og endringer i sialo-kjemien.
• Pasienter vil bli bedt om å avstå fra å røyke, drikke og tygge minst en time før spyttoppsamling for å unngå forstyrrelser av vann og mat i analysen.
• For å fjerne matrester fra munnen, vil pasientene bli bedt om å vaske munnen med vann før spyttoppsamling.
• Etter grundig skylling vil det gis et intervall på minst 10 minutter før innsamling av spyttprøver for å unngå prøvefortynning.
• Pasientene vil bli bedt om å spytte spyttet i et sterilisert falkerør på 15 ml.
• Omtrent 2-5 ml spytt vil bli samlet inn fra hver pasient.
• Pasienten vil bli informert og bedt om ikke å hoste opp slim.
• Etter spyttinnsamling vil prøver umiddelbart bli tatt med til laboratoriet for videre behandling.
• Spyttprøver vil bli sentrifugert ved 8000 rpm i 15 minutter ved 4˚C for å fjerne eventuelt celleavfall, og supernatanten vil bli samlet.
• Den oppsamlede supernatanten vil bli delt opp i mikrorør på 1 ml og vil bli lagret ved -80 °C inntil videre analyse (behandlingstiden for spytt holdes lavest mulig).

2.9.2 Spyttanalyse:

Enzymkoblet immunsorbentanalyse (sandwichteknikk):

CTX-nivåer i spyttprøver fra alle gruppene vil bli analysert med sandwich ELISA (Enzyme Linked Immunosorbent Assay) teknikk. ELISA-testing vil bli utført ved å bruke CTX-sett i henhold til produsentens instruksjoner. Platen som er forhåndsbelagt med antistoff spesifikt for Human CTX vil bli levert med settet. Standarder eller prøver legges til mikro-ELISA-platebrønnene som lar CTX binde seg til dets spesifikke antistoff. Etter fjerning av ubundet prøve, vil biotinylert CTX-deteksjonsantistoff tilsettes etterfulgt av vask med bufferen. Etter vask vil platen bli inkubert med Streptavidin-pepperrotperoksidase (HRP) som vil binde seg til deteksjonsantistoff. Etter inkubasjon vil ubundet Streptavidin-HRP vaskes bort. Til slutt tilsettes substratløsning. Intensiteten av fargen som utvikles er proporsjonal med mengden human CTX som er tilstede i prøven. Reaksjonen vil bli stoppet ved tilsetning av stoppløsning og absorbansen vil bli målt spektrofotometrisk ved 450 nm bølgelengde. Konsentrasjonen av CTX i prøver oppnås ved å sammenligne absorbansen til prøvene med standardene.

ELISA vil bli utført av hovedetterforsker av studien med hjelp av hennes medveileder i DRIBBS (Dow Research Institute of Biotechnology and Biomedical Sciences).