INVESTIGACIÓN DE LA EXPRESIÓN DE LOS NIVELES DE CTXI EN SALIVA CON CARGA TEMPRANA Y RETARDADA DE IMPLANTES DENTALES

40 pacientes que acuden a OPD de Dow International Dental College para la colocación de implantes en la mandíbula posterior (área molar) serán reclutados en el estudio.

Se colocarán en los pacientes implantes dentales disponibles en el Departamento de Pacientes Ambulatorios (OPD) de Dow International Dental College (DIDC). Los implantes dentales se colocarán según los protocolos estándar del Dr. Shaheen Ahmed.

Los pacientes se dividirán en dos grupos. Los pacientes del grupo A recibirán una carga temprana y el grupo B recibirá una carga convencional con prótesis.

Se evaluará la estabilidad del implante de cada paciente después de la cirugía, al mes, 2 meses y 3 meses con la ayuda de Periotest.

Se recolectará saliva de los pacientes de ambos grupos antes de la colocación del implante y los mismos días de las evaluaciones de Periotest después de la cirugía. La saliva se procesará y almacenará inmediatamente a -80oC. Posteriormente se realizará ELISA sándwich para análisis de expresión de CTX.

Los niveles de CTX antes de la cirugía de implante se utilizarán como valor de referencia en este estudio.

2.9.1 Método de recolección de saliva:

Se recolectará saliva entera no estimulada (WUS) de ambos grupos de estudio. El proceso de recolección de saliva es el siguiente:

• Se recolectarán muestras de saliva entre las 9 y las 11 a. m. para minimizar las variaciones diurnas en el flujo salival y los cambios en la química del sialo.
• Se pedirá a los pacientes que se abstengan de fumar, beber y masticar al menos una hora antes de la recolección de saliva para evitar interferencias del agua y los alimentos con el análisis.
• Para eliminar los restos de comida de la boca, se pedirá a los pacientes que se laven la boca con agua antes de recolectar la saliva.
• Después de enjuagar bien, se dará un intervalo de al menos 10 minutos antes de la recolección de muestras de saliva para evitar la dilución de la muestra.
• Se pedirá a los pacientes que escupan la saliva en un tubo Falcon esterilizado de 15 ml.
• Se recolectarán aproximadamente de 2 a 5 ml de saliva de cada paciente.
• Se informará al paciente y se le indicará que no tosa mucosidad.
• Después de la recolección de saliva, las muestras se llevarán inmediatamente al laboratorio para su posterior procesamiento.
• Las muestras de saliva se centrifugarán a 8000 rpm durante 15 minutos a 4 ° C para eliminar los restos celulares y se recolectará el sobrenadante.
• El sobrenadante recogido se dividirá en alícuotas en microtubos de 1 ml y se almacenará a -80 °C hasta su posterior análisis (el tiempo de procesamiento de la saliva se mantendrá lo más bajo posible).

2.9.2 Análisis salival:

Ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas (técnica sándwich):

Los niveles de CTX en muestras de saliva de todos los grupos se analizarán mediante la técnica sándwich ELISA (ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas). La prueba ELISA se realizará utilizando el kit CTX de acuerdo con las instrucciones del fabricante. La placa prerrecubierta con anticuerpo específico para Human CTX se proporcionará con el kit. Se añaden estándares o muestras a los pocillos de la placa micro ELISA, lo que permite que CTX se una a su anticuerpo específico. Después de retirar la muestra no unida, se agregará el anticuerpo de detección de CTX biotinilado y luego se lavará con el tampón. Después del lavado, la placa se incubará con estreptavidina-peroxidasa de rábano picante (HRP) que se unirá al anticuerpo de detección. Después de la incubación, la estreptavidina-HRP no unida se eliminará mediante lavado. Finalmente se agregará la solución de sustrato. La intensidad del color desarrollado es proporcional a la cantidad de CTX humana presente en la muestra. La reacción se detendrá añadiendo una solución de parada y la absorbancia se medirá espectrofotométricamente a una longitud de onda de 450 nm. La concentración de CTX en las muestras se obtiene comparando la absorbancia de las muestras con los estándares.

ELISA será realizado por el investigador principal del estudio con la ayuda de su cosupervisor en DRIBBS (Instituto de Investigación de Biotecnología y Ciencias Biomédicas de Dow).