CTXI-TASOJEN ILMOITTAMISEN TUTKIMUS SYLVESSÄ HAMMASIMMPLANTTIEN VARHAIS- JA VIIVELAUTTAMISESSA

Tutkimukseen otetaan mukaan 40 potilasta, jotka tulevat Dow International Dental Collegen OPD:hen implanttia varten takaleukalle (poskialue).

Dow International Dental Collegen (DIDC) avohoitoosastolla (OPD) saatavilla olevat hammasimplantit sijoitetaan potilaille. Tohtori Shaheen Ahmed sijoittaa hammasimplantit standardiprotokollien mukaisesti.

Potilaat jaetaan kahteen ryhmään. Ryhmän A potilaat kuormitetaan varhain, ja ryhmän B potilaat kuormitetaan perinteisesti proteesilla.

Jokaisen potilaan implantin stabiilisuus arvioidaan leikkauksen jälkeen 1 kuukauden, 2 kuukauden ja 3 kuukauden kohdalla Periotestin avulla.

Molemmissa ryhmissä potilailta kerätään sylki ennen implantin asettamista ja samoina päivinä kuin leikkauksen jälkeisten Periotest-arviointien aikana. Sylki käsitellään ja varastoidaan välittömästi -80 oC:ssa. Myöhemmin sandwich-ELISA suoritetaan CTX:n ilmentämisanalyysiä varten.

CTX-tasot ennen implanttileikkausta toimivat vertailuarvona tässä tutkimuksessa.

2.9.1 Syljenkeräysmenetelmä:

Kokonaista stimuloimatonta sylkeä (WUS) kerätään molemmista tutkimusryhmistä. Syljen keruuprosessi on seuraava:

• Sylkinäytteet kerätään klo 9-11 välisenä aikana vuorokausivaihtelun syljenvirtauksen ja sialokemian muutosten minimoimiseksi.
• Potilaita pyydetään pidättäytymään tupakoinnista, juomisesta ja pureskelusta vähintään tuntia ennen syljen keräämistä, jotta vesi ja ruoka eivät häiritse analyysiä.
• Ruokajätteen poistamiseksi suusta potilaita pyydetään pesemään suu vedellä ennen syljen keräämistä.
• Perusteellisen huuhtelun jälkeen annetaan vähintään 10 minuutin tauko ennen sylkinäytteiden ottoa näytteen laimentumisen välttämiseksi.
• Potilaita pyydetään sylkemään sylki steriloituun 15 ml:n haukkaputkeen.
• Jokaiselta potilaalta kerätään noin 2-5 ml sylkeä.
• Potilaalle kerrotaan ja häntä kehotetaan olemaan yskimättä limaa.
• Syljenkeräyksen jälkeen näytteet viedään välittömästi laboratorioon jatkokäsittelyä varten.
• Sylkinäytteet sentrifugoidaan nopeudella 8 000 rpm 15 minuuttia 4 °C:ssa mahdollisen solujätteen poistamiseksi ja supernatantti kerätään.
• Kerätty supernatantti jaetaan 1 ml:n mikroputkiin ja säilytetään -80 °C:ssa jatkoanalyysiin asti (syljen käsittelyaika pidetään mahdollisimman lyhyenä).

2.9.2 Sylkianalyysi:

Entsyymikytkentäinen immunosorbenttimääritys (sandwich-tekniikka):

CTX-tasot kaikkien ryhmien sylkinäytteissä analysoidaan sandwich ELISA (Enzyme Linked Immunosorbent Assay) -tekniikalla. ELISA-testi suoritetaan käyttämällä CTX-sarjaa valmistajan ohjeiden mukaisesti. Pakkauksen mukana toimitetaan levy, joka on esipäällystetty Human CTX:lle spesifisellä vasta-aineella. Standardeja tai näytteitä lisätään mikro-ELISA-levyn kuoppiin, mikä mahdollistaa CTX:n sitoutumisen spesifiseen vasta-aineeseensa. Sitoutumattoman näytteen poistamisen jälkeen lisätään biotinyloitua CTX-detektiovasta-ainetta, jonka jälkeen pestään puskurilla. Pesun jälkeen levyä inkuboidaan streptavidiini-piparjuuriperoksidaasilla (HRP), joka sitoutuu detektiovasta-aineeseen. Inkuboinnin jälkeen sitoutumaton Streptavidin-HRP pestään pois. Lopuksi lisätään substraattiliuos. Kehittyneen värin intensiteetti on verrannollinen näytteessä olevan ihmisen CTX:n määrään. Reaktio pysäytetään lisäämällä pysäytysliuosta ja absorbanssi mitataan spektrofotometrisesti 450 nm:n aallonpituudella. CTX:n pitoisuus näytteissä saadaan vertaamalla näytteiden absorbanssia standardeihin.

ELISA:n suorittaa tutkimuksen päätutkija DRIBBS:n (Dow Research Institute of Biotechnology and Biomedical Sciences) apuohjaajansa avulla.