INVESTIGAÇÃO DA EXPRESSÃO DOS NÍVEIS DE CTXI NA SALIVA COM CARREGAMENTO PRECOCE E RETARDADO DE IMPLANTES DENTÁRIOS

40 pacientes que chegam ao OPD do Dow International Dental College para colocação de implantes na região posterior da mandíbula (área molar) serão recrutados no estudo.

Os implantes dentários disponíveis no Departamento Ambulatorial (OPD) do Dow International Dental College (DIDC) serão colocados nos pacientes. Os implantes dentários serão colocados de acordo com os protocolos padrão do Dr. Shaheen Ahmed.

Os pacientes serão divididos em dois grupos. Os pacientes do Grupo A serão carregados precocemente e o grupo B será carregado convencionalmente com prótese.

Cada paciente será avaliado quanto à estabilidade do implante após a cirurgia, em 1 mês, 2 meses e 3 meses com auxílio do Periotest.

A saliva será coletada dos pacientes de ambos os grupos antes da colocação do implante e nos mesmos dias das avaliações do Periotest após a cirurgia. A saliva será processada e imediatamente armazenada a -80oC. Posteriormente será realizado ELISA sanduíche para análise expressional de CTX.

Os níveis de CTX antes da cirurgia de implante serão servidos como valor de referência neste estudo.

2.9.1 Método de Coleta de Saliva:

Saliva total não estimulada (WUS) será coletada de ambos os grupos de estudo. O processo de coleta de saliva é o seguinte:

• Amostras salivares serão coletadas entre 9h e 11h para minimizar variações diurnas no fluxo salivar e mudanças na química do sialo.
• Os pacientes serão orientados a abster-se de fumar, beber e mastigar pelo menos uma hora antes da coleta de saliva para evitar interferência de água e alimentos na análise.
• Para remover quaisquer restos de comida da boca, os pacientes serão solicitados a lavar a boca com água antes da coleta de saliva.
• Após enxaguar abundantemente, será dado um intervalo de pelo menos 10 minutos antes da coleta das amostras de saliva para evitar diluição da amostra.
• Os pacientes serão solicitados a cuspir a saliva em um tubo Falcon esterilizado de 15mL.
• Aproximadamente 2-5 mL de saliva serão coletados de cada paciente.
• O paciente será informado e instruído a não tossir muco.
• Após a coleta de saliva, as amostras serão imediatamente levadas ao laboratório para posterior processamento.
• As amostras salivares serão centrifugadas a 8.000 rpm por 15 min a 4˚C para remover quaisquer restos celulares e o sobrenadante será coletado.
• O sobrenadante coletado será dividido em microtubos de 1ml e será armazenado a -80°C até posterior análise (o tempo de processamento da saliva será mantido o menor possível).

2.9.2 Análise Salivar:

Ensaio de imunoabsorção enzimática (técnica sanduíche):

Os níveis de CTX nas amostras salivares de todos os grupos serão analisados ​​pela técnica sanduíche ELISA (Enzyme Linked Immunosorbent Assay). O teste ELISA será realizado usando o kit CTX de acordo com as instruções do fabricante. A placa pré-revestida com anticorpo específico para CTX Humano será fornecida junto com o kit. Padrões ou amostras são adicionados aos poços da placa micro ELISA, o que permite que o CTX se ligue ao seu anticorpo específico. Após a remoção da amostra não ligada, o anticorpo de detecção de CTX biotinilado será adicionado seguido de lavagem com o tampão. Após a lavagem, a placa será incubada com Estreptavidina-Peroxidase de Rábano Forte (HRP) que se ligará ao anticorpo de detecção. Após a incubação, a estreptavidina-HRP não ligada será eliminada. Finalmente, a solução de substrato será adicionada. A intensidade da cor desenvolvida é proporcional à quantidade de CTX humano presente na amostra. A reação será interrompida pela adição de solução de parada e a absorbância será medida espectrofotometricamente no comprimento de onda de 450 nm. A concentração de CTX nas amostras é obtida comparando a absorvância das amostras com os padrões.

O ELISA será realizado pela investigadora principal do estudo com a ajuda de seu coorientador no DRIBBS (Dow Research Institute of Biotechnology and Biomedical Sciences).