UNTERSUCHUNG DES AUSDRUCKS DES CTXI-GEHALTS IM SPEICHER BEI FRÜHER UND VERZÖGERTER BELASTUNG VON ZAHNIMPLANTATEN

Für die Studie werden 40 Patienten rekrutiert, die zur Implantatinsertion im hinteren Unterkiefer (Molarenbereich) zum OPD des Dow International Dental College kommen.

Den Patienten werden Zahnimplantate eingesetzt, die in der Ambulanz (OPD) des Dow International Dental College (DIDC) verfügbar sind. Zahnimplantate werden gemäß den Standardprotokollen von Dr. Shaheen Ahmed eingesetzt.

Die Patienten werden in zwei Gruppen eingeteilt. Patienten der Gruppe A werden früh belastet und Gruppe B wird konventionell mit Prothesen belastet.

Bei jedem Patienten wird die Implantatstabilität nach der Operation nach 1 Monat, 2 Monaten und 3 Monaten mit Hilfe von Periotest untersucht.

Speichel wird von Patienten beider Gruppen vor dem Einsetzen des Implantats und an denselben Tagen wie die Periotest-Bewertungen nach der Operation gesammelt. Speichel wird verarbeitet und sofort bei -80 °C gelagert. Später wird ein Sandwich-ELISA zur Expressionsanalyse von CTX durchgeführt.

Der CTX-Spiegel vor der Implantation wird in dieser Studie als Referenzwert dienen.

2.9.1 Speichelsammelmethode:

Von beiden Studiengruppen wird vollständiger unstimulierter Speichel (WUS) gesammelt. Der Ablauf der Speichelsammlung ist wie folgt:

• Speichelproben werden zwischen 9 und 11 Uhr entnommen, um tageszeitliche Schwankungen des Speichelflusses und Veränderungen in der Sialo-Chemie zu minimieren.
• Die Patienten werden gebeten, mindestens eine Stunde vor der Speichelentnahme auf das Rauchen, Trinken und Kauen zu verzichten, um eine Beeinträchtigung der Analyse durch Wasser und Nahrung zu vermeiden.
• Um Speisereste aus dem Mund zu entfernen, werden die Patienten gebeten, vor der Speichelentnahme den Mund mit Wasser zu spülen.
• Nach gründlichem Spülen wird vor der Entnahme der Speichelproben eine Pause von mindestens 10 Minuten eingelegt, um eine Probenverdünnung zu vermeiden.
• Die Patienten werden gebeten, den Speichel in ein sterilisiertes 15-ml-Falcon-Röhrchen zu spucken.
• Von jedem Patienten werden etwa 2–5 ml Speichel gesammelt.
• Der Patient wird informiert und angewiesen, keinen Schleim abzuhusten.
• Nach der Speichelgewinnung werden die Proben sofort zur weiteren Verarbeitung ins Labor gebracht.
• Speichelproben werden 15 Minuten lang bei 4 °C und 8.000 U/min zentrifugiert, um etwaige Zelltrümmer zu entfernen, und der Überstand wird gesammelt.
• Der gesammelte Überstand wird in 1-ml-Mikroröhrchen aufgeteilt und bis zur weiteren Analyse bei -80 °C gelagert (die Verarbeitungszeit des Speichels wird so kurz wie möglich gehalten).

2.9.2 Speichelanalyse:

Enzyme Linked Immunosorbent Assay (Sandwich-Technik):

Die CTX-Spiegel in Speichelproben aller Gruppen werden mittels Sandwich-ELISA-Technik (Enzyme Linked Immunosorbent Assay) analysiert. ELISA-Tests werden unter Verwendung des CTX-Kits gemäß den Anweisungen des Herstellers durchgeführt. Die mit humanem CTX-spezifischen Antikörpern vorbeschichtete Platte wird mit dem Kit geliefert. Standards oder Proben werden in die Vertiefungen der Mikro-ELISA-Platte gegeben, wodurch CTX an seinen spezifischen Antikörper binden kann. Nach dem Entfernen der ungebundenen Probe wird der biotinylierte CTX-Nachweisantikörper hinzugefügt und anschließend mit dem Puffer gewaschen. Nach dem Waschen wird die Platte mit Streptavidin-Meerrettich-Peroxidase (HRP) inkubiert, die an den Nachweisantikörper bindet. Nach der Inkubation wird ungebundenes Streptavidin-HRP weggewaschen. Abschließend wird Substratlösung hinzugefügt. Die Intensität der entwickelten Farbe ist proportional zur Menge an menschlichem CTX in der Probe. Die Reaktion wird durch Zugabe einer Stopplösung gestoppt und die Absorption wird spektrophotometrisch bei einer Wellenlänge von 450 nm gemessen. Die CTX-Konzentration in Proben wird durch Vergleich der Absorption der Proben mit den Standards ermittelt.

ELISA wird von der Hauptforscherin der Studie mit Hilfe ihres Co-Betreuers am DRIBBS (Dow Research Institute of Biotechnology and Biomedical Sciences) durchgeführt.