ONDERZOEK naar de expressie van CTXI-niveaus in speeksel met vroege en vertraagde belasting van tandimplantaten

Voor het onderzoek zullen 40 patiënten worden gerekruteerd die naar OPD van het Dow International Dental College komen voor plaatsing van implantaten in de achterste onderkaak (molaargebied).

Tandheelkundige implantaten die beschikbaar zijn op de polikliniek (OPD) van het Dow International Dental College (DIDC) zullen bij patiënten worden geplaatst. Tandimplantaten worden geplaatst volgens de standaardprotocollen van Dr. Shaheen Ahmed.

Patiënten zullen in twee groepen worden verdeeld. Patiënten uit groep A zullen vroeg belast worden en groep B zal conventioneel belast worden met een prothese.

Elke patiënt zal na de operatie, na 1 maand, 2 maanden en 3 maanden, worden geëvalueerd op de stabiliteit van het implantaat met behulp van Periotest.

Er wordt speeksel verzameld bij patiënten in beide groepen vóór plaatsing van het implantaat en op dezelfde dagen als de Periotest-evaluaties na de operatie. Speeksel wordt verwerkt en direct bij -80oC bewaard. Later zal sandwich-ELISA worden uitgevoerd voor expressieve analyse van CTX.

CTX-niveaus vóór implantaatchirurgie zullen in dit onderzoek als referentiewaarde dienen.

2.9.1 Speekselopvangmethode:

Van beide onderzoeksgroepen zal het gehele ongestimuleerde speeksel (WUS) worden verzameld. Het proces van het verzamelen van speeksel is als volgt:

• Speekselmonsters worden tussen 9.00 en 11.00 uur verzameld om dagelijkse variaties in de speekselproductie en veranderingen in de sialo-chemie te minimaliseren.
• Patiënten wordt gevraagd om ten minste één uur vóór de speekselafname niet te roken, drinken en kauwen om interferentie van water en voedsel met de analyse te voorkomen.
• Om voedselresten uit de mond te verwijderen, wordt de patiënten gevraagd de mond met water te spoelen voordat het speeksel wordt verzameld.
• Na grondig spoelen wordt er een interval van minimaal 10 minuten aangehouden voordat de speekselmonsters worden afgenomen om verdunning van het monster te voorkomen.
• Patiënten wordt gevraagd het speeksel in een gesteriliseerde Falcon-buis van 15 ml te spugen.
• Van elke patiënt wordt ongeveer 2-5 ml speeksel verzameld.
• De patiënt wordt geïnformeerd en verteld dat hij geen slijm mag ophoesten.
• Na de speekselafname worden de monsters direct naar het laboratorium gebracht voor verdere verwerking.
• Speekselmonsters worden gedurende 15 minuten bij 4˚C bij 8000 rpm gecentrifugeerd om eventueel celafval te verwijderen en het supernatant wordt verzameld.
• Het verzamelde supernatant wordt in microbuisjes van 1 ml verdeeld en bij -80°C bewaard tot verdere analyse (de verwerkingstijd van het speeksel wordt zo laag mogelijk gehouden).

2.9.2 Speekselanalyse:

Enzymgekoppelde immunosorbenttest (sandwichtechniek):

CTX-niveaus in speekselmonsters van alle groepen zullen worden geanalyseerd met behulp van de sandwich-ELISA-techniek (Enzyme Linked Immunosorbent Assay). ELISA-tests zullen worden uitgevoerd met behulp van de CTX-kit volgens de instructies van de fabrikant. De plaat die vooraf is gecoat met antilichaam dat specifiek is voor Human CTX, wordt bij de kit geleverd. Standaarden of monsters worden aan de micro-ELISA-plaatputjes toegevoegd, waardoor CTX aan zijn specifieke antilichaam kan binden. Na het verwijderen van het ongebonden monster wordt gebiotinyleerd CTX-detectieantilichaam toegevoegd, gevolgd door wassen met de buffer. Na het wassen wordt de plaat geïncubeerd met Streptavidine-mierikswortelperoxidase (HRP), dat zich aan detectieantilichaam zal binden. Na incubatie wordt ongebonden Streptavidine-HRP weggespoeld. Tenslotte wordt substraatoplossing toegevoegd. De ontwikkelde kleurintensiteit is evenredig met de hoeveelheid menselijke CTX die in het monster aanwezig is. De reactie zal worden gestopt door de toevoeging van een stopoplossing en de absorptie zal spectrofotometrisch worden gemeten bij een golflengte van 450 nm. De concentratie CTX in monsters wordt verkregen door de absorptie van monsters te vergelijken met de standaarden.

ELISA zal worden uitgevoerd door de hoofdonderzoeker van het onderzoek met de hulp van haar co-promotor bij DRIBBS (Dow Research Institute of Biotechnology and Biomedical Sciences).