UNDERSØGELSE af UDTRYK AF CTXI-NIVEAUER I SPYT MED TIDLIG og FORSINKET INDLÆSNING AF TANDIMPLANTATER

40 patienter, der kommer til OPD fra Dow International Dental College for implantatplacering i posterior mandible (molar område), vil blive rekrutteret i undersøgelsen.

Tandimplantater, der er tilgængelige i ambulatoriet (OPD) på Dow International Dental College (DIDC), vil blive placeret i patienter. Tandimplantater vil blive placeret i henhold til standardprotokollerne af Dr. Shaheen Ahmed.

Patienterne vil blive opdelt i to grupper. Gruppe A patienter vil blive belastet tidligt, og gruppe B vil blive konventionelt belastet med protese.

Hver patient vil blive evalueret for implantatstabilitet efter operationen efter 1 måned, 2 måneder og 3 måneder ved hjælp af Periotest.

Spyt vil blive opsamlet fra patienter i begge grupper før anbringelse af implantatet og på samme dage som for Periotest-evalueringer efter operationen. Spyt vil blive behandlet og straks opbevaret ved -80oC. Senere sandwich ELISA vil blive udført til ekspressionsanalyse af CTX.

Niveauer af CTX før implantatkirurgi vil blive brugt som referenceværdi i denne undersøgelse.

2.9.1 Spytopsamlingsmetode:

Helt ustimuleret spyt (WUS) vil blive indsamlet fra begge undersøgelsesgrupper. Processen med spytopsamling er som følger:

• Spytprøver vil blive indsamlet mellem kl. 9-11 for at minimere daglige variationer i spytflow og ændringer i sialokemien.
• Patienterne vil blive bedt om at afstå fra at ryge, drikke og tygge mindst en time før spytopsamling for at undgå forstyrrelse af vand og mad i analysen.
• For at fjerne madrester fra munden vil patienterne blive bedt om at vaske munden med vand før spytopsamling.
• Efter grundig skylning vil der blive givet et interval på mindst 10 minutter før indsamling af spytprøver for at undgå prøvefortynding.
• Patienterne vil blive bedt om at spytte spyttet i et steriliseret falkerør på 15 ml.
• Der opsamles ca. 2-5 ml spyt fra hver patient.
• Patienten vil blive informeret og bedt om ikke at hoste slim op.
• Efter spytopsamling vil prøver straks blive taget til laboratoriet for videre behandling.
• Spytprøver vil blive centrifugeret ved 8000 rpm i 15 minutter ved 4˚C for at fjerne eventuelle cellerester, og supernatanten vil blive opsamlet.
• Den opsamlede supernatant vil blive opdelt i mikrorør på 1 ml og vil blive opbevaret ved -80°C indtil videre analyse (behandlingstiden for spyt vil blive holdt lavest muligt).

2.9.2 Spytanalyse:

Enzym-linked immunosorbent assay (sandwich-teknik):

CTX-niveauer i spytprøver fra alle grupperne vil blive analyseret ved sandwich ELISA (Enzyme Linked Immunosorbent Assay) teknik. ELISA-testning vil blive udført ved at bruge CTX-kit i henhold til producentens anvisninger. Pladen, der er præ-coated med antistof, der er specifikt for Human CTX, leveres med sættet. Standarder eller prøver tilsættes til mikro ELISA-pladebrøndene, som tillader CTX at binde til dets specifikke antistof. Efter fjernelse af ubundet prøve tilsættes biotinyleret CTX-detektionsantistof efterfulgt af vask med bufferen. Efter vask vil pladen blive inkuberet med Streptavidin-Peberrodsperoxidase (HRP), som vil binde sig til detektionsantistof. Efter inkubation vil ubundet Streptavidin-HRP blive vasket væk. Til sidst tilsættes substratopløsning. Intensiteten af ​​den udviklede farve er proportional med mængden af ​​humant CTX til stede i prøven. Reaktionen vil blive stoppet ved tilsætning af stopopløsning, og absorbansen vil blive målt spektrofotometrisk ved 450 nm bølgelængde. Koncentrationen af ​​CTX i prøver opnås ved at sammenligne absorbans af prøver med standarderne.

ELISA vil blive udført af hovedforsker af undersøgelsen med hjælp fra hendes Co-supervisor i DRIBBS (Dow Research Institute of Biotechnology and Biomedical Sciences).