Antiinflammatorisk terapi med Anakinra ved nydiagnosticeret type 1-diabetes

Type 1-diabetes mellitus (T1D) er forårsaget af autoimmun og autoinflammatorisk ødelæggelse af de insulinproducerende betaceller i bugspytkirtlens øer i Langerhans. Historisk set har behandlingen for denne tilstand bestået af insulinerstatningsterapi og kostændringer. Nylige undersøgelser har vist de potentielle fordele ved immunmodulerende terapi hos patienter med nyligt diagnosticeret T1D for at forhindre yderligere immunmedieret skade. Hidtil har der været en mangel på afsluttet forskning ved hjælp af midler, der retter sig mod pro-inflammatoriske cytokiner dysreguleret i T1D.

IL1B, genet der koder for det proinflammatoriske cytokin interleukin-1β (IL-1β), er signifikant overudtrykt i perifere mononukleære blodceller (PBMC) hos patienter med nyligt diagnosticeret T1D sammenlignet med raske kontroller. Der er rigelig præcedens for at understøtte involveringen af ​​IL-1β i patogenesen af ​​diabetes. Især inkubation af humane eller animalske øer eller insulinomcellelinjer med IL-1β inhiberer insulinsekretion og fører til apoptose af betaceller.

Derudover forbedrer IL-1-receptorantagonistproteinet, anakinra, den glykæmiske kontrol og insulinsekretorisk kapacitet hos patienter med type 2-diabetes. Der er dog ikke offentliggjort data vedrørende effektiviteten af ​​midler rettet mod IL-1β til at modificere sygdomsforløbet hos patienter med T1D. Anti-Interleukin-1 in Diabetes Action (AIDA) er et randomiseret, placebokontrolleret klinisk forsøg med anakinra hos 160 voksne med nydiagnosticeret type 1-diabetes. Dette forsøg rekrutterer i øjeblikket forsøgspersoner. Gennemgang af clinicaltrials.gov demonstrerer to andre planlagte forsøg med IL-1-midler i nyligt diagnosticeret T1D, et ved hjælp af canakinumab, et monoklonalt antistof rettet mod IL-1β, og et andet ved hjælp af rilonacept, en cytokinfælde rettet mod IL-1β. For at vurdere effektiviteten af ​​disse lægemidler i fremtidige undersøgelser og i klinisk praksis, vil det være værdifuldt at identificere biomarkører, der giver os mulighed for at overvåge deres terapeutiske virkninger. Men så vidt vi ved, er mønstret af ændringer i genekspression induceret af IL-1β i normale PBMC ikke blevet systematisk undersøgt, hvilket gør det vanskeligt at identificere kandidatbiomarkører til valideringsundersøgelser.

I denne eksplorative undersøgelse havde vi til formål at bestemme, hvilke af de karakteristiske ændringer i genekspression fra patienter med nyligt diagnosticeret T1D, der er IL-1β-medieret, ved hjælp af både in vitro og in vivo tilgange. Vi bestemte også effektstørrelsen af ​​et kort forløb med anakinra-terapi på glykæmisk kontrol, insulindosering og C-peptidarealet under kurven under tolerancetest for blandet måltid (MMTT). Endelig evaluerede vi tolerabiliteten af ​​anakinra hos børn og unge med nyligt diagnosticeret T1D.

Metoder In vitro undersøgelser For at bestemme virkningerne af IL-1β på genekspression i perifere mononukleære blodceller (PBMC), blev blodprøver indsamlet fra 7 raske voksne frivillige under en IRB-godkendt protokol.

Isolerende serum. Blod blev opsamlet i EDTA-rør (BD, Franklin Lakes, NJ) og centrifugeret ved 2500 rpm i 15 minutter. Plasmalaget blev behandlet med topisk thrombin (5000 U/ml, King Pharmaceuticals, Bristol, TN) svarende til 5 % totalvolumen og inkuberet ved 38°C i 20 minutter. Den resulterende koagel blev fjernet fra serummet og kasseret.

Cellekultur. PBMC blev isoleret fra den cellulære fraktion ved centrifugering under anvendelse af lymfocytseparationsmedium (Mediatech, Manassas, VA) og vasket med PBS (Mediatech, Manassas, VA). Celler blev udpladet med 3 x 106 pr. brønd i plader med 6 brønde i RPMI 1640 (Mediatech) suppleret med 10% føtalt bovint serum (Atlanta Biologicals, Lawrenceville, GA), 10% autologt humant serum, 5,5 mM glucose, 100 U penicillin, 100 U penicillin µg/ml streptomycin, 50 µmol/l 2-mercaptoethanol og 5 % HEPES. IL-1β (15 ng/ml slutkoncentration, Abcam, Cambridge, MA) eller 9,3 µg/ml S100b (Sigma, St. Louis, MO) blev tilsat til nogle brønde. Alle eksperimentelle betingelser blev udpladet i tre eksemplarer. Celler blev opsamlet efter 24 timers inkubation ved 37°C i en 5% CO2-atmosfære.

Validering ved RT-PCR. Total RNA blev isoleret under anvendelse af RNA-Stat 60 (Tel-Test, Friendswood, TX). High Capacity cDNA Reverse Transcription Kit (Applied Biosystems, Carlsbad, CA) blev brugt med 750 ng RNA til at skabe cDNA. Realtids-PCR blev udført på Roche LightCycler 480-systemet under anvendelse af 5 ul af cDNA-prøven, Roche LightCycler Probes Master-kittet og humane IL1B-primere (Applied Biosystems). RNA blev kvantificeret ved delta Ct-værdier under anvendelse af GADPH som intern kontrol (Applied Biosystems).

Microarray analyse. Tredobbelte prøver for hver eksperimentel tilstand blev samlet til yderligere analyse. Fra 2-5 µg totalt RNA blev dobbeltstrenget cDNA indeholdende T7-dT(24)-promotorsekvensen genereret under anvendelse af GeneChip® One-Cycle cDNA Synthesis Kits (Invitrogen, Santa Clara, CA). Syntese af cRNA brugte 200 ng cDNA til in vitro transkriptions-, amplifikations- og mærkningstrin i henhold til producentens instruktioner ved brug af Illumina RNA-amplifikationskit (Ambion Inc, Austin, TX). 1,5 µg amplificeret biotin-mærket cRNA blev efterfølgende hybridiseret til Illumina Human HT-12 v3.0 Beadchip mikroarrays i henhold til standardprotokoller. ved Baylor Institute for Immunology Research, Dallas, TX.

Slides blev scannet på en Illumina Beadstation 500 og data behandlet med Beadstudio software. For hver chip blev rå intensitetsdata normaliseret til middelintensiteten af ​​alle målinger på den chip. Data blev importeret til Genespring GX11 (Agilent) til yderligere analyse. Probesæt blev valgt, hvis "tilstede" eller "Marginal" i mindst 50 % af prøverne i en hvilken som helst gruppe. Principal komponentanalyse blev udført for at påvise outliers. Klassesammenligninger blev udført ved hjælp af t-tests efter logtransformation med Type 1-fejlfrekvensen kontrolleret ved hjælp af Benjamini-Hochbergs falske opdagelsesrater (FDR).

In vivo undersøgelser Emner. Undersøgelsen blev godkendt af Institutional Review Board ved University of Texas Southwestern Medical Center. Der blev indhentet skriftligt informeret samtykke fra forældre eller værger, og samtykke til deltagelse blev indhentet fra forsøgspersoner på 10 år og ældre. Patienter på Children's Medical Center Dallas mellem 6 og 18 år med type 1-diabetes inden for en uge efter diagnosen var kvalificerede. Eksklusionskriterier omfattede behandling med systemiske eller inhalerede kortikosteroider eller et hvilket som helst andet immunmodulerende lægemiddel, aktiv infektion, historie med mykobakteriel sygdom, graviditet eller amning, brug af en levende vaccine inden for 90 dage efter indskrivningen i undersøgelsen og alvorlige følgesygdomme (såsom kronisk nyresygdom, hjerte). svigt eller ukontrolleret hypertension). Patienter blev ekskluderet, hvis det var uklart, om de havde type 1- eller type 2-diabetes.

Data indsamlet fra de medicinske diagrammer omfattede alder, køn, race/etnicitet, vægt, højde, hæmoglobin A1c (HbA1c) og beta-hydroxybutyrat ved diagnose. En blodprøve blev taget ved undersøgelsens start; en del blev analyseret for screeninglaboratorier, inklusive alaninaminotransferase (ALT), aspartataminotransferase (AST), blodurinstofnitrogen (BUN), kreatinin, fuldstændig blodtælling (CBC) med differential og serumgraviditetstest for alle menstruerende kvinder og enhver kvinde over alder 10 år. Derudover blev 20 ml behandlet til mikroarray-analyse.

Diabetesbehandling Ved diagnosen blev alle forsøgspersoner sat på en basal-bolus insulinbehandling med glargin og enten lispro eller aspart. I løbet af undersøgelsen blev insulindoser justeret efter standard klinikprotokol med målglukose på 80-140 mg/dL faste og 80-180 mg/dL før måltider. Ved hvert studiebesøg registrerede vi forsøgspersonens aktuelle insulindoser og vægt for at muliggøre beregning af den samlede daglige dosis (enheder/kg/dag).

Anakinra Efter tilmelding til studiet startede alle forsøgspersoner anakinra (Kineret; Amgen, Thousand Oaks, CA) som en subkutan daglig injektion. Forsøgspersoner, der vejede mere end 25 kg på indskrivningstidspunktet, fik 100 mg dagligt, mens personer, der vejede 25 kg eller mindre, fik 50 mg dagligt. Anakinra blev fortsat i i alt 28 dage uden dosisjustering.

Diabetesautoantistoffer I henhold til standardprotokol blev alle patienter testet for antistoffer mod insulin, proteintyrosinphosphatase-receptor type N (insulinom-associeret antigen (IA-2)) og glutaminsyredecarboxylase (ARUP Laboratories, Salt Lake City, UT). Resultaterne af disse undersøgelser var typisk ikke tilgængelige på tidspunktet for studietilmeldingen og blev derfor ikke brugt som kriterier for studieadgang. Vi udelukkede dog patienter med negative resultater for alle tre antistoffer fra yderligere analyse.

Overvågningslaboratorietests Efter afslutning af anakinra-behandling (4-5 uger efter diagnosen) blev der udtaget en blodprøve og sendt til ALT, AST, BUN, kreatinin og CBC med differential. I henhold til standardprotokol fik alle forsøgspersoner point-of-care hæmoglobin A1c (DCA Vantage Analyzer, Siemens Healthcare Diagnostics, Deerfield, IL) og kapillær glucose testet ved klinikbesøg 4-5 uger efter diagnosen, 4 måneder efter diagnosen og 7 måneder efter. diagnose.

Overvågning af uønskede hændelser I løbet af de 28 dage med anakinra-behandling tilkaldte undersøgelsespersonalet forsøgspersonerne ugentligt for at dokumentere hyppigheden af ​​hypoglykæmi og tilstedeværelsen af ​​udslæt, reaktioner på injektionsstedet (hævelse, erytem og smerter ved administrationsstedet for anakinra), hovedpine, feber og evt. andre uønskede hændelser. Efter afslutningen af ​​anakinra-behandlingen blev patienterne vurderet for bivirkninger ved hvert efterfølgende studiebesøg.

Blandede måltidstolerancetest (MMTT'er) MMTT'er blev udført ved University of Texas Southwestern Medical Center Clinical Translational Research Center (CTRC). Forsøgspersonerne gennemgik MMTT'er i det væsentlige som beskrevet (8) 3-4 uger efter diagnosen og igen 7 måneder efter diagnosen. C-peptidanalyser blev udført i laboratoriet hos Dr. Philip Raskin (UT Southwestern Medical Center, Dallas, TX).

Behandling af mikroarray-blodprøver Mikroarray-blodprøver blev opsamlet i EDTA-rør (BD Vacutainer) ved studieindskrivning, 3-4 uger efter diagnosen og efter afslutning af anakinra-behandling. PBMC blev isoleret og opbevaret ved -80°C inden for 4 timer efter blodudtagningen. Celler blev lyseret i RLT-lysebuffer indeholdende β-mercaptoethanol (Qiagen, Valencia, CA). Total RNA blev ekstraheret ved hjælp af RNeasy® Mini Kit i henhold til den producentens anbefalede protokol (Qiagen, Valencia, CA) og analyseret som beskrevet ovenfor.

Kontrolgrupper Fordi forsøgspersoner i anakinra-undersøgelsen ikke var randomiseret, brugte vi to forskellige allerede eksisterende kontrolgrupper. Forsøgspersoner i kontrolgruppe A var tidligere indskrevet på vores institution under en separat, IRB-godkendt protokol i et randomiseret, kontrolleret forsøg, der undersøgte effekten af ​​det indledende valg af længerevirkende insulin på hastigheden af ​​tab af beta-cellefunktion. Forsøgspersoner blev indskrevet under deres indlæggelse til diabetesdiagnose og randomiseret til at modtage enten NPH eller basal insulin (glargin eller detemir). Diabetesbehandling og rutinemæssige klinikbesøg, tidsplan og procedurer for tolerancetestning af blandet måltid og mikroarray-analyse var de samme som for vores anakinra-behandlede forsøgspersoner. Kontrolgruppe A omfatter alle patienter i denne undersøgelse randomiseret til at modtage basal insulin, undtagen dem med negativt autoantistof resultater.

Forsøgspersoner i kontrolgruppe B blev identificeret i en diagramgennemgang af alle nye diabetesdiagnoser fra april 2008 til november 2009 hos patienter i alderen 9-18 år (for at matche datointerval for rekruttering og alder for anakinra-behandlede forsøgspersoner). Forsøgspersoner blev inkluderet i denne kontrolgruppe, hvis de havde mindst ét ​​positivt autoantistof og ikke var inkluderet i anakinra-undersøgelsen. Vi indsamlede alder, køn, race/etnicitet, vægt, højde og beta-hydroxybutyrat ved diagnosen. Vi indsamlede også HbA1c og total daglig insulindosis (udtrykt som enheder/kg/dag) ved diagnose og ved klinikbesøg 1 måned, 4 måneder og 7 måneder efter diagnosen.

En undergruppe af 10 af disse forsøgspersoner gav samtykke til at deltage i en IRB-godkendt undersøgelse, hvor der blev udtaget blod til mikroarray-analyse ved diagnosen og igen 1 måned efter diagnosen. Mikroarray-procedurer var de samme som beskrevet ovenfor for de anakinra-behandlede individer.

Statistisk analyse Der blev udarbejdet beskrivende statistikker, og alle sammenlignende analyser blev udført ved brug af SAS version 9.2 (Cary, NC). C-peptidarealet under kurven (AUC) blev beregnet for hver MMTT ved anvendelse af den trapezformede metode. Insulindosisjusteret A1c (IDAA1c) blev beregnet som skitseret af Mortensen, et. al. (9), IDAA1c = hæmoglobin A1C (procent) + [4 × insulindosis (enheder pr. kilogram pr. 24 timer)]. Hæmoglobin A1c og IDAA1c mellem grupperne blev sammenlignet ved hjælp af Wilcoxon rank-sum tests. Da den samlede daglige insulindosis var normalfordelt, blev sammenligninger mellem grupper udført ved standard t-test.