Terapia antiinflamatoria con anakinra en diabetes tipo 1 recién diagnosticada

La diabetes mellitus tipo 1 (T1D) es causada por la destrucción autoinmune y autoinflamatoria de las células beta productoras de insulina en los islotes pancreáticos de Langerhans. Históricamente, el tratamiento de esta afección ha consistido en terapia de reemplazo de insulina y modificación de la dieta. Estudios recientes han demostrado los beneficios potenciales de la terapia inmunomoduladora en pacientes con diabetes Tipo 1 recientemente diagnosticada para prevenir más daño inmunomediado. Hasta el momento, ha habido una escasez de investigaciones completas que utilicen agentes que se dirijan a las citocinas proinflamatorias desreguladas en la DT1.

IL1B, el gen que codifica la citocina proinflamatoria interleucina-1β (IL-1β) se sobreexpresa significativamente en células mononucleares de sangre periférica (PBMC) en pacientes con DT1 recién diagnosticada en comparación con controles sanos. Existe un amplio precedente para apoyar la participación de IL-1β en la patogénesis de la diabetes. En particular, la incubación de islotes humanos o animales o líneas celulares de insulinoma con IL-1β inhibe la secreción de insulina y conduce a la apoptosis de las células beta.

Además, la proteína antagonista del receptor de IL-1, anakinra, mejora el control glucémico y la capacidad secretora de insulina en pacientes con diabetes tipo 2. Sin embargo, no se han publicado datos sobre la eficacia de los agentes dirigidos a la IL-1β para modificar el curso de la enfermedad en pacientes con DT1. Anti-Interleukin-1 in Diabetes Action (AIDA) es un ensayo clínico aleatorizado y controlado con placebo de anakinra en 160 adultos con diagnóstico reciente de diabetes tipo 1. Este ensayo actualmente está reclutando sujetos. Revisión de Clinicaltrials.gov demuestra otros dos ensayos planificados de agentes IL-1 en DT1 recién diagnosticados, uno que usa canakinumab, un anticuerpo monoclonal dirigido a IL-1β, y otro que usa rilonacept, una trampa de citoquinas dirigida a IL-1β. Para evaluar la efectividad de estos fármacos en futuros estudios y en la práctica clínica, será valioso identificar biomarcadores que nos permitan monitorear sus efectos terapéuticos. Sin embargo, hasta donde sabemos, el patrón de cambios en la expresión génica inducidos por IL-1β en PBMC normales no se ha estudiado sistemáticamente, lo que dificulta la identificación de biomarcadores candidatos para estudios de validación.

En este estudio exploratorio, nuestro objetivo fue determinar cuáles de los cambios característicos en la expresión génica de pacientes con DT1 recién diagnosticada están mediados por IL-1β, utilizando enfoques tanto in vitro como in vivo. También determinamos el tamaño del efecto de un curso corto de terapia con anakinra sobre el control glucémico, la dosificación de insulina y el área bajo la curva del péptido C durante la prueba de tolerancia a comidas mixtas (MMTT). Finalmente, evaluamos la tolerabilidad de anakinra en niños y adolescentes con DT1 recién diagnosticada.

Métodos Estudios in vitro Para determinar los efectos de IL-1β en la expresión génica en células mononucleares de sangre periférica (PBMC), se recolectaron muestras de sangre de 7 voluntarios adultos sanos bajo un protocolo aprobado por el IRB.

Suero aislante. La sangre se recogió en tubos EDTA (BD, Franklin Lakes, NJ) y se centrifugó a 2500 rpm durante 15 minutos. La capa de plasma se trató con trombina tópica (5000 U/ml, King Pharmaceuticals, Bristol, TN) equivalente al 5% del volumen total y se incubó a 38° durante 20 minutos. El coágulo resultante se extrajo del suero y se descartó.

Cultivo de células. Las PBMC se aislaron de la fracción celular mediante centrifugación usando medio de separación de linfocitos (Mediatech, Manassas, VA) y se lavaron con PBS (Mediatech, Manassas, VA). Las células se colocaron en placas a razón de 3 x 106 por pocillo en placas de 6 pocillos en RPMI 1640 (Mediatech) complementado con suero bovino fetal al 10 % (Atlanta Biologicals, Lawrenceville, GA), suero humano autólogo al 10 %, glucosa 5,5 mM, 100 U de penicilina, 100 U de estreptomicina µg/ml, 2-mercaptoetanol 50 µmol/l y HEPES al 5%. Se añadió IL-1β (concentración final de 15 ng/ml, Abcam, Cambridge, MA) o 9,3 µg/ml de S100b (Sigma, St. Louis, MO) a algunos pocillos. Todas las condiciones experimentales se sembraron por triplicado. Las células se recolectaron después de 24 horas de incubación a 37°C en una atmósfera de CO2 al 5%.

Validación por RT-PCR. El ARN total se aisló usando RNA-Stat 60 (Tel-Test, Friendswood, TX). Se usó el kit de transcripción inversa de ADNc de alta capacidad (Applied Biosystems, Carlsbad, CA) con 750 ng de ARN para crear ADNc. La PCR en tiempo real se realizó en el sistema Roche LightCycler 480 usando 5 ul de la muestra de ADNc, el kit Roche LightCycler Probes Master y cebadores IL1B humanos (Applied Biosystems). El ARN se cuantificó mediante valores delta Ct utilizando GADPH como control interno (Applied Biosystems).

Análisis de micromatrices. Se agruparon muestras por triplicado para cada condición experimental para su posterior análisis. A partir de 2-5 µg de ARN total, se generó ADNc de doble cadena que contenía la secuencia del promotor T7-dT(24) utilizando los kits de síntesis de ADNc de un ciclo GeneChip® (Invitrogen, Santa Clara, CA). La síntesis de cRNA usó 200 ng de cDNA para los pasos de transcripción, amplificación y marcaje in vitro de acuerdo con las instrucciones del fabricante usando el kit de amplificación de RNA Illumina (Ambion Inc, Austin, TX). Posteriormente, se hibridaron 1,5 µg de ARNc marcado con biotina amplificado con micromatrices Illumina Human HT-12 v3.0 Beadchip de acuerdo con los protocolos estándar. en el Instituto Baylor para la Investigación Inmunológica, Dallas, TX.

Los portaobjetos se escanearon en un Illumina Beadstation 500 y los datos se procesaron con el software Beadstudio. Para cada chip, los datos de intensidad sin procesar se normalizaron a la intensidad media de todas las mediciones en ese chip. Los datos se importaron a Genespring GX11 (Agilent) para su posterior análisis. Los conjuntos de sondas se seleccionaron si estaban "Presentes" o "Marginales" en al menos el 50% de las muestras en cualquier grupo. Se realizó un análisis de componentes principales para detectar valores atípicos. Las comparaciones de clase se realizaron utilizando pruebas t después de la transformación logarítmica con la tasa de error de tipo 1 controlada utilizando tasas de descubrimiento falso (FDR) de Benjamini-Hochberg.

Estudios in vivo Sujetos. El estudio fue aprobado por la Junta de Revisión Institucional del Centro Médico Southwestern de la Universidad de Texas. Se obtuvo el consentimiento informado por escrito de los padres o tutores legales, y el asentimiento para la participación se obtuvo de sujetos mayores de 10 años. Los pacientes del Children's Medical Center Dallas entre las edades de 6 y 18 años con diabetes tipo 1 dentro de la semana posterior al diagnóstico fueron elegibles. Los criterios de exclusión incluyeron tratamiento con corticosteroides sistémicos o inhalados o cualquier otro fármaco inmunomodulador, infección activa, antecedentes de enfermedad micobacteriana, embarazo o lactancia, uso de una vacuna viva dentro de los 90 días posteriores a la inscripción en el estudio y comorbilidades graves (como enfermedad renal crónica, enfermedad cardíaca). insuficiencia cardíaca o hipertensión no controlada). Los pacientes fueron excluidos si no estaba claro si tenían diabetes tipo 1 o tipo 2.

Los datos recopilados de las historias clínicas incluyeron edad, sexo, raza/etnicidad, peso, altura, hemoglobina A1c (HbA1c) y beta-hidroxibutirato en el momento del diagnóstico. Se obtuvo una muestra de sangre al ingreso al estudio; una parte se analizó para laboratorios de detección, incluidos alanina aminotransferasa (ALT), aspartato aminotransferasa (AST), nitrógeno ureico en sangre (BUN), creatinina, hemograma completo (CBC) con diferencial y prueba de embarazo en suero para todas las mujeres que menstrúan y cualquier mujer mayor edad 10 años Además, se procesaron 20 ml para el análisis de micromatrices.

Atención de la diabetes En el momento del diagnóstico, todos los sujetos recibieron un régimen de insulina en bolo basal con glargina y lispro o aspart. Durante la duración del estudio, las dosis de insulina se ajustaron según el protocolo clínico estándar con una glucosa objetivo de 80 a 140 mg/dl en ayunas y de 80 a 180 mg/dl antes de las comidas. En cada visita del estudio, registramos las dosis actuales de insulina y el peso del sujeto para permitir el cálculo de la dosis diaria total (unidades/kg/día).

Anakinra Después de la inscripción en el estudio, todos los sujetos comenzaron con anakinra (Kineret; Amgen, Thousand Oaks, CA) como inyección subcutánea diaria. Los sujetos que pesaban más de 25 kg en el momento de la inscripción recibieron 100 mg al día, mientras que los que pesaban 25 kg o menos recibieron 50 mg al día. Anakinra se continuó durante un total de 28 días sin ajuste de dosis.

Autoanticuerpos de la diabetes Según el protocolo estándar, se analizó a todos los pacientes para detectar anticuerpos contra la insulina, el receptor de proteína tirosina fosfatasa tipo N (antígeno asociado al insulinoma (IA-2)) y ácido glutámico descarboxilasa (ARUP Laboratories, Salt Lake City, UT). Los resultados de estos estudios generalmente no estaban disponibles en el momento de la inscripción en el estudio y, por lo tanto, no se utilizaron como criterios para ingresar al estudio. Sin embargo, excluimos a los pacientes con resultados negativos para los tres anticuerpos de análisis posteriores.

Pruebas de laboratorio de vigilancia Al finalizar la terapia con anakinra (4-5 semanas después del diagnóstico), se recolectó una muestra de sangre y se envió para ALT, AST, BUN, creatinina y CBC con diferencial. Según el protocolo estándar, a todos los sujetos se les analizó la hemoglobina A1c en el punto de atención (DCA Vantage Analyzer, Siemens Healthcare Diagnostics, Deerfield, IL) y la glucosa capilar en las visitas a la clínica 4-5 semanas después del diagnóstico, 4 meses después del diagnóstico y 7 meses después. diagnóstico.

Monitoreo de eventos adversos Durante los 28 días de terapia con anakinra, el personal del estudio llamó a los sujetos semanalmente para documentar la frecuencia de hipoglucemia y la presencia de erupción cutánea, reacciones en el lugar de la inyección (hinchazón, eritema y dolor en el lugar de administración de anakinra), dolores de cabeza, fiebre y cualquier otros eventos adversos. Después de completar la terapia con anakinra, se evaluó a los pacientes para detectar eventos adversos en cada visita posterior del estudio.

Pruebas mixtas de tolerancia a comidas (MMTT) Las MMTT se realizaron en el Centro de Investigación Clínica Traslacional (CTRC) del Centro Médico Southwestern de la Universidad de Texas. Los sujetos se sometieron a MMTT esencialmente como se describe (8) a las 3-4 semanas después del diagnóstico y nuevamente a los 7 meses después del diagnóstico. Los análisis de péptido C se realizaron en el laboratorio del Dr. Philip Raskin (UT Southwestern Medical Center, Dallas, TX).

Procesamiento de muestras de sangre en micromatrices Las muestras de sangre en micromatrices se recogieron en tubos con EDTA (BD Vacutainer) en el momento de la inscripción en el estudio, 3 o 4 semanas después del diagnóstico y al finalizar la terapia con anakinra. Las PBMC se aislaron y almacenaron a -80 °C dentro de las 4 horas posteriores a la extracción de sangre. Las células se lisaron en tampón de lisis RLT que contenía β-mercaptoetanol (Qiagen, Valencia, CA). El ARN total se extrajo con el RNeasy® Mini Kit de acuerdo con el protocolo recomendado por el fabricante (Qiagen, Valencia, CA) y se analizó como se describe anteriormente.

Grupos de control Debido a que los sujetos del estudio de anakinra no fueron aleatorizados, utilizamos dos grupos de control preexistentes diferentes. Los sujetos del grupo de control A se inscribieron previamente en nuestra institución bajo un protocolo separado aprobado por el IRB en un ensayo controlado aleatorizado que examinó el efecto de la elección inicial de insulina de acción más prolongada en la tasa de pérdida de la función de las células beta. Los sujetos se inscribieron durante su hospitalización por diagnóstico de diabetes y se aleatorizaron para recibir NPH o insulina basal (glargina o detemir). El cuidado de la diabetes y las visitas clínicas de rutina, el cronograma y los procedimientos para las pruebas de tolerancia a comidas mixtas y el análisis de micromatrices fueron los mismos que para nuestros sujetos tratados con anakinra. El grupo de control A incluye a todos los pacientes en ese estudio aleatorizados para recibir insulina basal, excepto aquellos con autoanticuerpos negativos. resultados.

Los sujetos del grupo de control B se identificaron en una revisión de gráficos de todos los nuevos diagnósticos de diabetes desde abril de 2008 hasta noviembre de 2009 en pacientes de 9 a 18 años (para coincidir con el rango de fechas de reclutamiento y la edad de los sujetos tratados con anakinra). Los sujetos se incluyeron en este grupo de control si tenían al menos un autoanticuerpo positivo y no estaban inscritos en el estudio de anakinra. Recolectamos edad, sexo, raza/etnicidad, peso, altura y beta-hidroxibutirato en el momento del diagnóstico. También recolectamos la HbA1c y la dosis diaria total de insulina (expresada como unidades/kg/día) en el momento del diagnóstico y para las visitas a la clínica al mes, 4 meses y 7 meses después del diagnóstico.

Un subconjunto de 10 de estos sujetos consintió en inscribirse en un estudio aprobado por el IRB en el que se extrajo sangre para análisis de micromatrices en el momento del diagnóstico y nuevamente 1 mes después del diagnóstico. Los procedimientos de micromatriz fueron los mismos que los descritos anteriormente para los sujetos tratados con anakinra.

Análisis estadístico Se compilaron estadísticas descriptivas y todos los análisis comparativos se realizaron utilizando SAS versión 9.2 (Cary, NC). El área bajo la curva (AUC) del péptido C se calculó para cada MMTT utilizando el método trapezoidal. Alabama. (9), IDAA1c = hemoglobina A1C (porcentaje) + [4 × dosis de insulina (unidades por kilogramo por 24 h)]. La hemoglobina A1c y la IDAA1c entre los grupos se compararon mediante pruebas de suma de rangos de Wilcoxon. Dado que la dosis diaria total de insulina se distribuyó normalmente, las comparaciones entre grupos se realizaron mediante la prueba t estándar.