Entzündungshemmende Therapie mit Anakinra bei neu diagnostiziertem Typ-1-Diabetes

Typ-1-Diabetes mellitus (T1D) wird durch autoimmune und autoinflammatorische Zerstörung der insulinproduzierenden Betazellen in den Langerhans-Inseln der Bauchspeicheldrüse verursacht. In der Vergangenheit bestand die Behandlung dieser Erkrankung aus einer Insulinersatztherapie und einer Ernährungsumstellung. Jüngste Studien haben den potenziellen Nutzen einer immunmodulatorischen Therapie bei Patienten mit neu diagnostiziertem T1D gezeigt, um weitere immunvermittelte Schäden zu verhindern. Bisher gab es nur wenige abgeschlossene Forschungsarbeiten mit Wirkstoffen, die auf entzündungsfördernde Zytokine abzielen, die bei T1D fehlreguliert sind.

IL1B, das Gen, das für das proinflammatorische Zytokin Interleukin-1β (IL-1β) kodiert, wird in peripheren mononukleären Blutzellen (PBMC) bei Patienten mit neu diagnostiziertem T1D im Vergleich zu gesunden Kontrollpersonen signifikant überexprimiert. Es gibt zahlreiche Präzedenzfälle, die die Beteiligung von IL-1β an der Pathogenese von Diabetes unterstützen. Insbesondere die Inkubation von menschlichen oder tierischen Inseln oder Insulinomzelllinien mit IL-1β hemmt die Insulinsekretion und führt zur Apoptose von Betazellen.

Darüber hinaus verbessert das IL-1-Rezeptorantagonistenprotein Anakinra die glykämische Kontrolle und die Insulinsekretionskapazität bei Patienten mit Typ-2-Diabetes. Es wurden jedoch keine Daten zur Wirksamkeit von Wirkstoffen veröffentlicht, die auf IL-1β abzielen, um den Krankheitsverlauf bei Patienten zu verändern mit T1D. Anti-Interleukin-1 in Diabetes Action (AIDA) ist eine randomisierte, placebokontrollierte klinische Studie mit Anakinra bei 160 Erwachsenen mit neu diagnostiziertem Typ-1-Diabetes. Für diese Studie werden derzeit Probanden rekrutiert. Überprüfung von clinicaltrials.gov zeigt zwei weitere geplante Studien mit IL-1-Wirkstoffen bei neu diagnostiziertem T1D, eine mit Canakinumab, einem gegen IL-1β gerichteten monoklonalen Antikörper, und eine andere mit Rilonacept, einer Zytokinfalle, die auf IL-1β abzielt. Um die Wirksamkeit dieser Medikamente in zukünftigen Studien und in der klinischen Praxis zu beurteilen, wird es wertvoll sein, Biomarker zu identifizieren, die es uns ermöglichen, ihre therapeutischen Wirkungen zu überwachen. Nach unserem besten Wissen wurde jedoch das Muster der durch IL-1β in normalen PBMC induzierten Veränderungen der Genexpression nicht systematisch untersucht, was es schwierig macht, Kandidaten-Biomarker für Validierungsstudien zu identifizieren.

In dieser explorativen Studie wollten wir bestimmen, welche der charakteristischen Veränderungen in der Genexpression von Patienten mit neu diagnostiziertem T1D IL-1β-vermittelt sind, wobei sowohl In-vitro- als auch In-vivo-Ansätze verwendet wurden. Wir haben auch die Effektgröße einer kurzen Anakinra-Therapie auf die glykämische Kontrolle, die Insulindosierung und die C-Peptid-Fläche unter der Kurve während des Mixed-Meal-Toleranztests (MMTT) bestimmt. Schließlich bewerteten wir die Verträglichkeit von Anakinra bei Kindern und Jugendlichen mit neu diagnostiziertem T1D.

Methoden In-vitro-Studien Um die Wirkungen von IL-1β auf die Genexpression in peripheren mononukleären Blutzellen (PBMC) zu bestimmen, wurden Blutproben von 7 gesunden erwachsenen Freiwilligen gemäß einem vom IRB genehmigten Protokoll entnommen.

Serum isolieren. Blut wurde in EDTA-Röhrchen (BD, Franklin Lakes, NJ) gesammelt und 15 Minuten bei 2500 U/min zentrifugiert. Die Plasmaschicht wurde mit topischem Thrombin (5000 E/ml, King Pharmaceuticals, Bristol, TN) entsprechend 5 % Gesamtvolumen behandelt und 20 Minuten bei 38° inkubiert. Das resultierende Gerinnsel wurde aus dem Serum entfernt und verworfen.

Zellkultur. PBMC wurden aus der Zellfraktion durch Zentrifugation unter Verwendung von Lymphocyte Separation Medium (Mediatech, Manassas, VA) isoliert und mit PBS (Mediatech, Manassas, VA) gewaschen. Zellen wurden mit 3 x 106 pro Vertiefung in Platten mit 6 Vertiefungen in RPMI 1640 (Mediatech), ergänzt mit 10 % fötalem Rinderserum (Atlanta Biologicals, Lawrenceville, GA), 10 % autologem Humanserum, 5,5 mM Glucose, 100 U Penicillin, 100 ausplattiert µg/ml Streptomycin, 50 µmol/l 2-Mercaptoethanol und 5 % HEPES. IL-1β (15 ng/ml Endkonzentration, Abcam, Cambridge, MA) oder 9,3 &mgr;g/ml S100b (Sigma, St. Louis, MO) wurden einigen Vertiefungen zugesetzt. Alle experimentellen Bedingungen wurden dreifach ausplattiert. Die Zellen wurden nach 24-stündiger Inkubation bei 37°C in einer 5% CO 2 -Atmosphäre gesammelt.

Validierung durch RT-PCR. Gesamt-RNA wurde unter Verwendung von RNA-Stat 60 (Tel-Test, Friendswood, TX) isoliert. Das High Capacity cDNA Reverse Transcription Kit (Applied Biosystems, Carlsbad, CA) wurde mit 750 ng RNA verwendet, um cDNA zu erzeugen. Echtzeit-PCR wurde auf dem Roche LightCycler 480-System unter Verwendung von 5 &mgr;l der cDNA-Probe, dem Roche LightCycler Probes Master Kit und humanen IL1B-Primern (Applied Biosystems) durchgeführt. RNA wurde durch Delta-Ct-Werte unter Verwendung von GADPH als interner Kontrolle (Applied Biosystems) quantifiziert.

Microarray-Analyse. Dreifache Proben für jede experimentelle Bedingung wurden zur weiteren Analyse gepoolt. Aus 2–5 &mgr;g Gesamt-RNA wurde doppelsträngige cDNA, die die T7-dT(24)-Promotorsequenz enthielt, unter Verwendung von GeneChip ® -One-Cycle-cDNA-Synthesekits (Invitrogen, Santa Clara, CA) erzeugt. Die cRNA-Synthese verwendete 200 ng cDNA für die In-vitro-Transkriptions-, Amplifikations- und Markierungsschritte gemäß den Anweisungen des Herstellers unter Verwendung des Illumina RNA-Amplifikationskits (Ambion Inc, Austin, TX). 1,5 µg amplifizierte Biotin-markierte cRNA wurden anschließend gemäß Standardprotokollen an Illumina Human HT-12 v3.0 Beadchip-Microarrays hybridisiert. am Baylor Institute for Immunology Research, Dallas, TX.

Die Objektträger wurden auf einer Illumina Beadstation 500 gescannt und die Daten mit der Beadstudio-Software verarbeitet. Für jeden Chip wurden die rohen Intensitätsdaten auf die mittlere Intensität aller Messungen auf diesem Chip normalisiert. Die Daten wurden zur weiteren Analyse in Genespring GX11 (Agilent) importiert. Sondensätze wurden ausgewählt, wenn sie in mindestens 50 % der Proben in jeder Gruppe „vorhanden“ oder „geringfügig“ waren. Eine Hauptkomponentenanalyse wurde durchgeführt, um Ausreißer zu erkennen. Klassenvergleiche wurden unter Verwendung von t-Tests nach Log-Transformation durchgeführt, wobei die Typ-1-Fehlerrate unter Verwendung von Benjamini-Hochberg-False-Discovery-Raten (FDR) kontrolliert wurde.

In-vivo-Studien Themen. Die Studie wurde vom Institutional Review Board des Southwestern Medical Center der University of Texas genehmigt. Die schriftliche Einverständniserklärung wurde von den Eltern oder Erziehungsberechtigten eingeholt, und die Zustimmung zur Teilnahme wurde von Probanden im Alter von 10 Jahren und älter eingeholt. Teilnahmeberechtigt waren Patienten im Children's Medical Center Dallas im Alter zwischen 6 und 18 Jahren mit Typ-1-Diabetes innerhalb einer Woche nach der Diagnose. Zu den Ausschlusskriterien gehörten die Behandlung mit systemischen oder inhalativen Kortikosteroiden oder anderen immunmodulatorischen Arzneimitteln, eine aktive Infektion, eine mykobakterielle Erkrankung in der Vorgeschichte, Schwangerschaft oder Stillzeit, die Verwendung eines Lebendimpfstoffs innerhalb von 90 Tagen nach Studieneinschluss und schwere Komorbiditäten (wie chronische Nierenerkrankung, Herz-Kreislauf-Erkrankung). Versagen oder unkontrollierter Bluthochdruck). Patienten wurden ausgeschlossen, wenn unklar war, ob sie Typ-1- oder Typ-2-Diabetes hatten.

Die aus den Krankenakten gesammelten Daten umfassten Alter, Geschlecht, Rasse/ethnische Zugehörigkeit, Gewicht, Größe, Hämoglobin A1c (HbA1c) und Beta-Hydroxybutyrat zum Zeitpunkt der Diagnose. Bei Studieneintritt wurde eine Blutprobe entnommen; Ein Teil wurde für Screening-Labore analysiert, einschließlich Alanin-Aminotransferase (ALT), Aspartat-Aminotransferase (AST), Blut-Harnstoff-Stickstoff (BUN), Kreatinin, komplettes Blutbild (CBC) mit Differenzial- und Serum-Schwangerschaftstest für alle menstruierenden Frauen und alle Frauen darüber Alter 10 Jahre. Zusätzlich wurden 20 ml für die Microarray-Analyse verarbeitet.

Diabetesversorgung Zum Zeitpunkt der Diagnose erhielten alle Probanden eine Basal-Bolus-Insulinbehandlung mit Glargin und entweder Lispro oder Aspart. Für die Dauer der Studie wurden die Insulindosen gemäß dem klinischen Standardprotokoll mit Zielglukosewerten von 80–140 mg/dl nüchtern und 80–180 mg/dl vor den Mahlzeiten angepasst. Bei jedem Studienbesuch zeichneten wir die aktuellen Insulindosen und das Gewicht des Probanden auf, um die Berechnung der täglichen Gesamtdosis (Einheiten/kg/Tag) zu ermöglichen.

Anakinra Nach der Aufnahme in die Studie begannen alle Probanden mit Anakinra (Kineret; Amgen, Thousand Oaks, CA) als subkutane tägliche Injektion. Personen, die zum Zeitpunkt der Aufnahme mehr als 25 kg wogen, erhielten 100 mg täglich, während Personen mit einem Gewicht von 25 kg oder weniger täglich 50 mg erhielten. Anakinra wurde für insgesamt 28 Tage ohne Dosisanpassung fortgesetzt.

Diabetes-Autoantikörper Gemäß Standardprotokoll wurden alle Patienten auf Antikörper gegen Insulin, Protein-Tyrosin-Phosphatase-Rezeptor Typ N (Insulinom-assoziiertes Antigen (IA-2)) und Glutaminsäuredecarboxylase (ARUP Laboratories, Salt Lake City, UT) getestet. Die Ergebnisse dieser Studien waren in der Regel zum Zeitpunkt der Studieneinschreibung noch nicht verfügbar und wurden daher nicht als Kriterien für den Studieneintritt verwendet. Wir schlossen jedoch Patienten mit negativen Ergebnissen für alle drei Antikörper von der weiteren Analyse aus.

Überwachungslabortests Nach Abschluss der Anakinra-Therapie (4-5 Wochen nach der Diagnose) wurde eine Blutprobe entnommen und für ALT, AST, BUN, Kreatinin und CBC mit Differential eingesandt. Gemäß dem Standardprotokoll wurden bei allen Probanden Hämoglobin A1c (DCA Vantage Analyzer, Siemens Healthcare Diagnostics, Deerfield, IL) und Kapillarglukose bei Klinikbesuchen 4-5 Wochen nach der Diagnose, 4 Monate nach der Diagnose und 7 Monate danach am Point-of-Care getestet Diagnose.

Überwachung von Nebenwirkungen Während der 28 Tage der Anakinra-Therapie rief das Studienpersonal die Probanden wöchentlich an, um die Häufigkeit von Hypoglykämie und das Vorhandensein von Hautausschlag, Reaktionen an der Injektionsstelle (Schwellung, Erythem und Schmerzen an der Stelle der Anakinra-Verabreichung), Kopfschmerzen, Fieber und dergleichen zu dokumentieren andere unerwünschte Ereignisse. Nach Abschluss der Anakinra-Therapie wurden die Patienten bei jedem weiteren Studienbesuch auf unerwünschte Ereignisse untersucht.

Mixed Meal Tolerance Tests (MMTTs) MMTTs wurden am Clinical Translational Research Center (CTRC) des Southwestern Medical Center der University of Texas durchgeführt. Die Probanden unterzogen sich MMTTs im Wesentlichen wie beschrieben (8) 3–4 Wochen nach der Diagnose und erneut 7 Monate nach der Diagnose. C-Peptid-Analysen wurden im Labor von Dr. Philip Raskin (UT Southwestern Medical Center, Dallas, TX) durchgeführt.

Microarray-Blutprobenverarbeitung Microarray-Blutproben wurden in EDTA-Röhrchen (BD Vacutainer) bei der Aufnahme in die Studie, 3-4 Wochen nach der Diagnose und nach Abschluss der Anakinra-Therapie gesammelt. PBMC wurden isoliert und innerhalb von 4 Stunden nach der Blutentnahme bei –80°C gelagert. Die Zellen wurden in RLT-Lysepuffer, enthaltend β-Mercaptoethanol (Qiagen, Valencia, CA), lysiert. Gesamt-RNA wurde unter Verwendung des RNeasy® Mini-Kits gemäß dem vom Hersteller empfohlenen Protokoll (Qiagen, Valencia, CA) extrahiert und wie oben beschrieben analysiert.

Kontrollgruppen Da die Probanden in der Anakinra-Studie nicht randomisiert wurden, verwendeten wir zwei verschiedene bereits bestehende Kontrollgruppen. Die Probanden der Kontrollgruppe A wurden zuvor an unserer Einrichtung im Rahmen eines separaten, vom IRB genehmigten Protokolls in eine randomisierte, kontrollierte Studie aufgenommen, in der die Wirkung der anfänglichen Wahl eines länger wirkenden Insulins auf die Verlustrate der Betazellfunktion untersucht wurde. Die Probanden wurden während ihres Krankenhausaufenthalts zur Diabetesdiagnose aufgenommen und randomisiert, um entweder NPH oder Basalinsulin (Glargin oder Detemir) zu erhalten. Diabetesversorgung und routinemäßige Klinikbesuche, Zeitplan und Verfahren für Mischmahlzeiten-Toleranztests und Microarray-Analysen waren die gleichen wie bei unseren mit Anakinra behandelten Probanden. Kontrollgruppe A umfasst alle Patienten in dieser Studie, die randomisiert wurden, um Basalinsulin zu erhalten, mit Ausnahme derjenigen mit negativem Autoantikörper Ergebnisse.

Die Probanden in Kontrollgruppe B wurden in einer Diagrammübersicht aller neuen Diabetesdiagnosen von April 2008 bis November 2009 bei Patienten im Alter von 9 bis 18 Jahren identifiziert (entsprechend dem Datumsbereich der Rekrutierung und dem Alter der mit Anakinra behandelten Probanden). Probanden wurden in diese Kontrollgruppe aufgenommen, wenn sie mindestens einen positiven Autoantikörper aufwiesen und nicht in die Anakinra-Studie aufgenommen wurden. Wir haben Alter, Geschlecht, Rasse/ethnische Zugehörigkeit, Gewicht, Größe und Beta-Hydroxybutyrat bei der Diagnose erfasst. Wir haben auch HbA1c und die tägliche Gesamtinsulindosis (ausgedrückt als Einheiten/kg/Tag) bei der Diagnose und für Klinikbesuche 1 Monat, 4 Monate und 7 Monate nach der Diagnose erhoben.

Eine Untergruppe von 10 dieser Probanden stimmte der Teilnahme an einer vom IRB genehmigten Studie zu, in der Blut für die Microarray-Analyse bei der Diagnose und erneut 1 Monat nach der Diagnose entnommen wurde. Die Microarray-Verfahren waren die gleichen wie oben für die mit Anakinra behandelten Probanden beschrieben.

Statistische Analyse Unter Verwendung von SAS Version 9.2 (Cary, NC) wurden beschreibende Statistiken erstellt und alle Vergleichsanalysen durchgeführt. Die C-Peptid-Fläche unter der Kurve (AUC) wurde für jede MMTT unter Verwendung der Trapezmethode berechnet. Der durch die Insulindosis angepasste A1c (IDAA1c) wurde wie von Mortensen et. Al. (9), IDAA1c = Hämoglobin A1C (Prozent) + [4 × Insulindosis (Einheiten pro Kilogramm pro 24 h)]. Hämoglobin A1c und IDAA1c zwischen den Gruppen wurden unter Verwendung von Wilcoxon-Rangsummentests verglichen. Da die tägliche Gesamtinsulindosis normal verteilt war, wurden Vergleiche zwischen den Gruppen durch einen Standard-t-Test durchgeführt.