Antiinflammatorisk terapi med Anakinra ved nydiagnostisert type 1 diabetes

Type 1 diabetes mellitus (T1D) er forårsaket av autoimmun og autoinflammatorisk ødeleggelse av de insulinproduserende betacellene i bukspyttkjerteløyene i Langerhans. Historisk sett har behandling for denne tilstanden bestått av insulinerstatningsterapi og kostholdsendringer. Nyere studier har vist de potensielle fordelene med immunmodulerende terapi hos pasienter med nylig diagnostisert T1D for å forhindre ytterligere immun-mediert skade. Så langt har det vært en mangel på fullført forskning ved bruk av midler som retter seg mot pro-inflammatoriske cytokiner dysregulert i T1D.

IL1B, genet som koder for det proinflammatoriske cytokinet interleukin-1β (IL-1β) er betydelig overuttrykt i perifere mononukleære blodceller (PBMC) hos pasienter med nylig diagnostisert T1D sammenlignet med friske kontroller. Det er rikelig med presedens for å støtte involveringen av IL-1β i patogenesen av diabetes. Spesielt inkubering av menneskelige eller dyreøyer eller insulinomcellelinjer med IL-1β hemmer insulinsekresjon og fører til apoptose av betaceller.

I tillegg forbedrer IL-1-reseptorantagonistproteinet, anakinra, glykemisk kontroll og insulinsekretorisk kapasitet hos pasienter med type 2-diabetes. Det er imidlertid ikke publisert data angående effekten av midler rettet mot IL-1β for å modifisere sykdomsforløpet hos pasienter med T1D. Anti-Interleukin-1 in Diabetes Action (AIDA) er en randomisert, placebokontrollert klinisk studie av anakinra hos 160 voksne med nydiagnostisert type 1 diabetes. Denne utprøvingen rekrutterer for tiden forsøkspersoner. Gjennomgang av clinicaltrials.gov viser to andre planlagte studier av IL-1-midler i nylig diagnostisert T1D, en ved bruk av canakinumab, et monoklonalt antistoff rettet mot IL-1β, og en annen ved bruk av rilonacept, en cytokinfelle rettet mot IL-1β. For å vurdere effektiviteten til disse legemidlene i fremtidige studier og i klinisk praksis, vil det være verdifullt å identifisere biomarkører som lar oss overvåke deres terapeutiske effekter. Men så vidt vi vet, har mønsteret av endringer i genuttrykk indusert av IL-1β i normal PBMC ikke blitt systematisk studert, noe som gjør det vanskelig å identifisere kandidatbiomarkører for valideringsstudier.

I denne utforskende studien hadde vi som mål å bestemme hvilke av de karakteristiske endringene i genuttrykk fra pasienter med nylig diagnostisert T1D som er IL-1β-mediert, ved bruk av både in vitro og in vivo tilnærminger. Vi bestemte også effektstørrelsen av en kort kur med anakinra-terapi på glykemisk kontroll, insulindosering og C-peptidområdet under kurven under toleransetesting for blandet måltid (MMTT). Til slutt evaluerte vi tolerabiliteten av anakinra hos barn og ungdom med nylig diagnostisert T1D.

Metoder In vitro-studier For å bestemme effekten av IL-1β på genuttrykk i perifere mononukleære blodceller (PBMC), ble blodprøver tatt fra 7 friske voksne frivillige under en IRB-godkjent protokoll.

Isolerende serum. Blod ble samlet i EDTA-rør (BD, Franklin Lakes, NJ) og sentrifugert ved 2500 rpm i 15 minutter. Plasmalaget ble behandlet med topisk trombin (5000 U/ml, King Pharmaceuticals, Bristol, TN) tilsvarende 5 % totalt volum og inkubert ved 38°C i 20 minutter. Den resulterende koagel ble fjernet fra serumet og kastet.

Cellekultur. PBMC ble isolert fra den cellulære fraksjonen ved sentrifugering ved bruk av lymfocyttseparasjonsmedium (Mediatech, Manassas, VA) og vasket med PBS (Mediatech, Manassas, VA). Celler ble sådd ut med 3 x 106 per brønn i 6-brønners plater i RPMI 1640 (Mediatech) supplert med 10 % føtalt bovint serum (Atlanta Biologicals, Lawrenceville, GA), 10 % autologt humant serum, 5,5 mM glukose, 100 U penicillin, 100 U penicillin µg/ml streptomycin, 50 µmol/l 2-merkaptoetanol og 5 % HEPES. IL-1β (15 ng/ml sluttkonsentrasjon, Abcam, Cambridge, MA), eller 9,3 µg/ml S100b (Sigma, St. Louis, MO) ble tilsatt til noen brønner. Alle eksperimentelle betingelser ble sådd ut i tre eksemplarer. Celler ble samlet etter 24 timers inkubering ved 37°C i en 5% CO2-atmosfære.

Validering ved RT-PCR. Totalt RNA ble isolert ved å bruke RNA-Stat 60 (Tel-Test, Friendswood, TX). High Capacity cDNA Reverse Transcription Kit (Applied Biosystems, Carlsbad, CA) ble brukt med 750 ng RNA for å lage cDNA. Sanntids-PCR ble utført på Roche LightCycler 480-systemet ved bruk av 5 ul av cDNA-prøven, Roche LightCycler Probes Master-settet og humane IL1B-primere (Applied Biosystems). RNA ble kvantifisert ved delta Ct-verdier ved å bruke GADPH som intern kontroll (Applied Biosystems).

Mikroarray analyse. Trippelprøver for hver eksperimentelle tilstand ble samlet for videre analyse. Fra 2-5 µg totalt RNA ble dobbelttrådet cDNA inneholdende T7-dT(24)-promotersekvensen generert ved bruk av GeneChip® One-Cycle cDNA Synthesis Kits (Invitrogen, Santa Clara, CA). Syntese av cRNA brukte 200 ng cDNA for in vitro transkripsjon, amplifikasjon og merkingstrinn i henhold til produsentens instruksjoner ved bruk av Illumina RNA-amplifikasjonssettet (Ambion Inc, Austin, TX). 1,5 µg amplifisert biotin-merket cRNA ble deretter hybridisert til Illumina Human HT-12 v3.0 Beadchip mikroarrayer i henhold til standardprotokoller. ved Baylor Institute for Immunology Research, Dallas, TX.

Lysbilder ble skannet på en Illumina Beadstation 500 og data behandlet med Beadstudio-programvare. For hver brikke ble rå intensitetsdata normalisert til gjennomsnittlig intensitet for alle målinger på den brikken. Data ble importert til Genespring GX11 (Agilent) for videre analyse. Probesett ble valgt hvis "Tilstede" eller "Marginal" i minst 50 % av prøvene i en hvilken som helst gruppe. Hovedkomponentanalyse ble utført for å oppdage uteliggere. Klassesammenligninger ble utført ved bruk av t-tester etter loggtransformasjon med Type 1 feilrate kontrollert ved bruk av Benjamini-Hochberg falske oppdagelsesrater (FDR).

In vivo-studier Emner. Studien ble godkjent av Institutional Review Board ved University of Texas Southwestern Medical Center. Skriftlig informert samtykke ble innhentet fra foreldre eller foresatte, og samtykke for deltakelse ble innhentet fra forsøkspersoner i alderen 10 år og eldre. Pasienter ved Children's Medical Center Dallas mellom 6 og 18 år med type 1-diabetes innen én uke etter diagnose var kvalifisert. Eksklusjonskriterier inkluderte behandling med systemiske eller inhalerte kortikosteroider eller andre immunmodulerende medikamenter, aktiv infeksjon, historie med mykobakteriell sykdom, graviditet eller amming, bruk av en levende vaksine innen 90 dager etter studieregistrering og alvorlige komorbiditeter (som kronisk nyresykdom, hjerte). svikt eller ukontrollert hypertensjon). Pasienter ble ekskludert hvis det var uklart om de hadde type 1 eller type 2 diabetes.

Data samlet inn fra de medisinske diagrammene inkluderte alder, kjønn, rase/etnisitet, vekt, høyde, hemoglobin A1c (HbA1c) og beta-hydroksybutyrat ved diagnose. En blodprøve ble tatt ved studiestart; en del ble analysert for screeninglaboratorier inkludert alaninaminotransferase (ALT), aspartataminotransferase (AST), blodureanitrogen (BUN), kreatinin, fullstendig blodtelling (CBC) med differensial, og serumgraviditetstest for alle menstruerende kvinner og kvinner over kvinner alder 10 år. I tillegg ble 20 ml behandlet for mikroarray-analyse.

Diabetesbehandling Ved diagnose ble alle forsøkspersoner satt på et basalbolusinsulinregime med glargin og enten lispro eller aspart. I løpet av studien ble insulindosene justert i henhold til standard klinikkprotokoll med målglukose på 80-140 mg/dL fastende og 80-180 mg/dL før måltider. Ved hvert studiebesøk registrerte vi forsøkspersonens nåværende insulindoser og vekt for å tillate beregning av den totale daglige dosen (enheter/kg/dag).

Anakinra Etter studieregistrering startet alle forsøkspersoner anakinra (Kineret; Amgen, Thousand Oaks, CA) som en subkutan daglig injeksjon. Forsøkspersoner som veide mer enn 25 kg på registreringstidspunktet fikk 100 mg daglig, mens de som veide 25 kg eller mindre fikk 50 mg daglig. Anakinra ble fortsatt i totalt 28 dager uten dosejustering.

Diabetes autoantistoffer I henhold til standard protokoll ble alle pasienter testet for antistoffer mot insulin, proteintyrosinfosfatasereseptor type N (insulinomassosiert antigen (IA-2)) og glutaminsyredekarboksylase (ARUP Laboratories, Salt Lake City, UT). Resultatene av disse studiene var vanligvis ikke tilgjengelige ved studieopptaket og ble derfor ikke brukt som kriterier for studieopptak. Imidlertid ekskluderte vi pasienter med negative resultater for alle tre antistoffene fra videre analyse.

Overvåkingslaboratorietester Etter avsluttet anakinrabehandling (4-5 uker etter diagnose) ble det tatt en blodprøve og sendt for ALT, AST, BUN, kreatinin og CBC med differensial. I henhold til standardprotokollen fikk alle pasientene hemoglobin A1c (DCA Vantage Analyzer, Siemens Healthcare Diagnostics, Deerfield, IL) og kapillærglukose testet ved klinikkbesøk 4-5 uker etter diagnose, 4 måneder etter diagnose og 7 måneder etter. diagnose.

Bivirkningsovervåking I løpet av de 28 dagene med anakinra-behandling ringte studiepersonell forsøkspersonene ukentlig for å dokumentere hyppigheten av hypoglykemi og tilstedeværelse av utslett, reaksjoner på injeksjonsstedet (hevelse, erytem og smerter ved administreringsstedet for anakinra), hodepine, feber og evt. andre uønskede hendelser. Etter fullført anakinra-behandling ble pasientene vurdert for uønskede hendelser ved hvert påfølgende studiebesøk.

Mixed meal tolerance tests (MMTTs) MMTTs ble utført ved University of Texas Southwestern Medical Center Clinical Translational Research Center (CTRC). Forsøkspersonene gjennomgikk MMTTs hovedsakelig som beskrevet (8) 3-4 uker etter diagnosen og igjen 7 måneder etter diagnosen. C-peptidanalyser ble utført i laboratoriet til Dr. Philip Raskin (UT Southwestern Medical Center, Dallas, TX).

Behandling av mikroarray-blodprøver Mikroarray-blodprøver ble samlet inn i EDTA-rør (BD Vacutainer) ved studieregistrering, 3-4 uker etter diagnose og ved fullført anakinra-behandling. PBMC ble isolert og lagret ved -80°C innen 4 timer etter blodprøvetakingen. Celler ble lysert i RLT lyseringsbuffer inneholdende β-merkaptoetanol (Qiagen, Valencia, CA). Totalt RNA ble ekstrahert ved bruk av RNeasy® Mini Kit i henhold til produsentens anbefalte protokoll (Qiagen, Valencia, CA) og analysert som beskrevet ovenfor.

Kontrollgrupper Fordi forsøkspersoner i anakinra-studien ikke ble randomisert, brukte vi to forskjellige forhåndseksisterende kontrollgrupper. Forsøkspersoner i kontrollgruppe A ble tidligere registrert ved vår institusjon under en egen, IRB-godkjent protokoll i en randomisert, kontrollert studie som undersøkte effekten av det første valget av langtidsvirkende insulin på frekvensen av tap av betacellefunksjon. Forsøkspersoner ble registrert under sykehusinnleggelsen for diabetesdiagnose og randomisert til å motta enten NPH eller basal insulin (glargin eller detemir). Diabetesbehandling og rutinemessige klinikkbesøk, tidsplan og prosedyrer for toleransetesting for blandet måltid og mikroarray-analyse var de samme som for våre anakinra-behandlede forsøkspersoner. Kontrollgruppe A inkluderer alle pasienter i den studien randomisert til å motta basal insulin, bortsett fra de med negativt autoantistoff resultater.

Personer i kontrollgruppe B ble identifisert i en kartgjennomgang av alle nye diabetesdiagnoser fra april 2008 til november 2009 hos pasienter i alderen 9-18 år (for å matche datointervallet for rekruttering og alderen til anakinra-behandlede forsøkspersoner). Forsøkspersoner ble inkludert i denne kontrollgruppen hvis de hadde minst ett positivt autoantistoff og ikke var registrert i anakinra-studien. Vi samlet inn alder, kjønn, rase/etnisitet, vekt, høyde og beta-hydroksybutyrat ved diagnose. Vi samlet også inn HbA1c og total daglig insulindose (uttrykt som enheter/kg/dag) ved diagnose og ved klinikkbesøk 1 måned, 4 måneder og 7 måneder etter diagnose.

En undergruppe av 10 av disse forsøkspersonene samtykket til å delta i en IRB-godkjent studie der blod ble tappet for mikroarray-analyse ved diagnose og igjen 1 måned etter diagnose. Mikroarray-prosedyrer var de samme som beskrevet ovenfor for anakinra-behandlede individer.

Statistisk analyse Beskrivende statistikk ble utarbeidet og alle komparative analyser utført ved bruk av SAS versjon 9.2 (Cary, NC). C-peptidarealet under kurven (AUC) ble beregnet for hver MMTT ved bruk av trapesmetoden. Insulindosejustert A1c (IDAA1c) ble beregnet som skissert av Mortensen, et. al. (9), IDAA1c = hemoglobin A1C (prosent) + [4 × insulindose (enheter per kilogram per 24 timer)]. Hemoglobin A1c og IDAA1c mellom grupper ble sammenlignet ved bruk av Wilcoxon rangsum-tester. Siden total daglig insulindose var normalfordelt, ble sammenligninger mellom grupper utført med standard t-test.