Terapia przeciwzapalna Anakinrą w nowo zdiagnozowanej cukrzycy typu 1

Cukrzyca typu 1 (T1D) jest spowodowana autoimmunologicznym i autozapalnym zniszczeniem komórek beta produkujących insulinę w wysepkach trzustkowych Langerhansa. Historycznie leczenie tego schorzenia polegało na zastępczej terapii insulinowej i modyfikacji diety. Ostatnie badania wykazały potencjalne korzyści terapii immunomodulacyjnej u pacjentów z nowo rozpoznaną T1D w zapobieganiu dalszym uszkodzeniom o podłożu immunologicznym. Do tej pory brakowało ukończonych badań z użyciem środków ukierunkowanych na cytokiny prozapalne rozregulowane w T1D.

IL1B, gen kodujący prozapalną cytokinę, interleukinę-1β (IL-1β), ulega znacznej nadekspresji w jednojądrzastych komórkach krwi obwodowej (PBMC) u pacjentów z nowo zdiagnozowaną T1D w porównaniu ze zdrowymi osobami z grupy kontrolnej. Istnieje wiele precedensów potwierdzających udział IL-1β w patogenezie cukrzycy. W szczególności inkubacja ludzkich lub zwierzęcych wysepek lub linii komórkowych insulinoma z IL-1β hamuje wydzielanie insuliny i prowadzi do apoptozy komórek beta.

Dodatkowo białko antagonista receptora IL-1, anakinra, poprawia kontrolę glikemii i zdolność wydzielania insuliny u pacjentów z cukrzycą typu 2. Nie opublikowano jednak danych dotyczących skuteczności leków celujących w IL-1β w modyfikacji przebiegu choroby u pacjentów z T1D. Anti-Interleukin-1 in Diabetes Action (AIDA) to randomizowane, kontrolowane placebo badanie kliniczne anakinry u 160 osób dorosłych z nowo zdiagnozowaną cukrzycą typu 1. W tej próbie trwa obecnie rekrutacja uczestników. Przegląd badań klinicznych.gov przedstawia dwa inne planowane badania czynników IL-1 w nowo zdiagnozowanej T1D, jedno z użyciem kanakinumabu, przeciwciała monoklonalnego skierowanego przeciwko IL-1β, a drugie z zastosowaniem rylonaceptu, pułapki cytokinowej ukierunkowanej na IL-1β. Aby ocenić skuteczność tych leków w przyszłych badaniach i praktyce klinicznej, cenne będzie zidentyfikowanie biomarkerów, które pozwolą nam monitorować ich działanie terapeutyczne. Jednak, zgodnie z naszą najlepszą wiedzą, wzór zmian w ekspresji genów indukowanych przez IL-1β w normalnych PBMC nie był systematycznie badany, co utrudnia identyfikację potencjalnych biomarkerów do badań walidacyjnych.

W tym eksploracyjnym badaniu staraliśmy się określić, które z charakterystycznych zmian w ekspresji genów u pacjentów z nowo zdiagnozowaną T1D są zależne od IL-1β, stosując zarówno podejście in vitro, jak i in vivo. Określiliśmy również wielkość efektu krótkiego cyklu terapii anakinrą na kontrolę glikemii, dawkowanie insuliny i powierzchnię peptydu C pod krzywą podczas testu tolerancji posiłków mieszanych (MMTT). Na koniec oceniliśmy tolerancję anakinry u dzieci i młodzieży z nowo rozpoznaną T1D.

Metody Badania in vitro Aby określić wpływ IL-1β na ekspresję genów w jednojądrzastych komórkach krwi obwodowej (PBMC), pobrano próbki krwi od 7 zdrowych dorosłych ochotników zgodnie z protokołem zatwierdzonym przez IRB.

Serum izolujące. Krew zebrano do probówek z EDTA (BD, Franklin Lakes, NJ) i wirowano przy 2500 obr./min przez 15 minut. Warstwę osocza potraktowano miejscową trombiną (5000 U/ml, King Pharmaceuticals, Bristol, TN) równą 5% całkowitej objętości i inkubowano w 38° przez 20 minut. Otrzymany skrzep usunięto z surowicy i odrzucono.

Hodowlę komórkową. PBMC wyizolowano z frakcji komórkowej przez odwirowanie z użyciem pożywki do rozdzielania limfocytów (Mediatech, Manassas, VA) i przemyto PBS (Mediatech, Manassas, VA). Komórki wysiano w ilości 3 x 106 na dołek w 6-dołkowych płytkach w RPMI 1640 (Mediatech) uzupełnionym 10% płodową surowicą bydlęcą (Atlanta Biologicals, Lawrenceville, GA), 10% autologiczną ludzką surowicą, 5,5 mM glukozy, 100 U penicyliny, 100 U µg/ml streptomycyny, 50 µmol/l 2-merkaptoetanolu i 5% HEPES. Do niektórych dołków dodano IL-1β (końcowe stężenie 15 ng/ml, Abcam, Cambridge, MA) lub 9,3 ug/ml S100b (Sigma, St. Louis, MO). Wszystkie warunki doświadczalne wysiano w trzech powtórzeniach. Komórki zebrano po 24 godzinach inkubacji w 37°C w atmosferze 5% CO2.

Walidacja metodą RT-PCR. Całkowity RNA wyizolowano stosując RNA-Stat 60 (Tel-Test, Friendswood, TX). Zestaw do odwrotnej transkrypcji cDNA o dużej pojemności (Applied Biosystems, Carlsbad, CA) został użyty z 750 ng RNA do stworzenia cDNA. PCR w czasie rzeczywistym przeprowadzono w systemie Roche LightCycler 480 przy użyciu 5 ul próbki cDNA, zestawu Roche LightCycler Probes Master kit i ludzkich starterów IL1B (Applied Biosystems). RNA oznaczano ilościowo za pomocą wartości delta Ct stosując GADPH jako kontrolę wewnętrzną (Applied Biosystems).

Analiza mikromacierzy. Próbki w trzech powtórzeniach dla każdego warunku eksperymentalnego połączono do dalszej analizy. Z 2-5 ug całkowitego RNA wygenerowano dwuniciowy cDNA zawierający sekwencję promotora T7-dT(24) przy użyciu zestawów GeneChip® One-Cycle cDNA Synthesis Kits (Invitrogen, Santa Clara, CA). W syntezie cRNA wykorzystano 200 ng cDNA do etapów transkrypcji, amplifikacji i znakowania in vitro zgodnie z instrukcjami producenta przy użyciu zestawu do amplifikacji RNA Illumina (Ambion Inc, Austin, TX). 1,5 µg zamplifikowanego cRNA znakowanego biotyną hybrydyzowano następnie z mikromacierzami Illumina Human HT-12 v3.0 Beadchip zgodnie ze standardowymi protokołami. w Baylor Institute for Immunology Research, Dallas, TX.

Slajdy skanowano na urządzeniu Illumina Beadstation 500, a dane przetwarzano za pomocą oprogramowania Beadstudio. Dla każdego chipa surowe dane dotyczące intensywności zostały znormalizowane do średniej intensywności wszystkich pomiarów na tym chipie. Dane importowano do Genespring GX11 (Agilent) do dalszej analizy. Zestawy sond wybrano, jeśli były „obecne” lub „marginalne” w co najmniej 50% próbek w dowolnej grupie. Przeprowadzono analizę głównych składowych w celu wykrycia wartości odstających. Porównania klas przeprowadzono za pomocą testów t po transformacji logarytmicznej z poziomem błędu typu 1 kontrolowanym za pomocą wskaźników fałszywego wykrywania Benjaminiego-Hochberga (FDR).

Badania in vivo Przedmioty. Badanie zostało zatwierdzone przez Institutional Review Board of the University of Texas Southwestern Medical Center. Pisemną świadomą zgodę uzyskano od rodziców lub opiekunów prawnych, a zgodę na udział uzyskano od osób w wieku 10 lat i starszych. Kwalifikowali się pacjenci z Children's Medical Center Dallas w wieku od 6 do 18 lat z cukrzycą typu 1 w ciągu jednego tygodnia od rozpoznania. Kryteria wykluczenia obejmowały leczenie ogólnoustrojowymi lub wziewnymi kortykosteroidami lub jakimkolwiek innym lekiem immunomodulującym, czynną infekcją, prątkami w wywiadzie, ciążą lub laktacją, zastosowaniem żywej szczepionki w ciągu 90 dni od włączenia do badania oraz ciężkimi chorobami współistniejącymi (takimi jak przewlekła choroba nerek, choroba serca). niepowodzenie lub niekontrolowane nadciśnienie). Pacjenci byli wykluczani, jeśli nie było jasne, czy mają cukrzycę typu 1 czy typu 2.

Dane zebrane z kart medycznych obejmowały wiek, płeć, rasę/pochodzenie etniczne, wagę, wzrost, hemoglobinę A1c (HbA1c) i beta-hydroksymaślan w chwili rozpoznania. Próbkę krwi pobrano na początku badania; część została przeanalizowana pod kątem badań przesiewowych w laboratoriach, w tym aminotransferazy alaninowej (ALT), aminotransferazy asparaginianowej (AST), azotu mocznikowego we krwi (BUN), kreatyniny, pełnej morfologii krwi (CBC) z rozróżnieniem i testu ciążowego w surowicy dla wszystkich kobiet miesiączkujących i kobiet powyżej wiek 10 lat. Dodatkowo, 20 ml poddano obróbce do analizy mikromacierzy.

Opieka nad cukrzycą W momencie rozpoznania wszyscy pacjenci otrzymywali insulinę w schemacie baza-bolus z glargine i lispro lub aspart. W czasie trwania badania dawki insuliny dostosowywano zgodnie ze standardowym protokołem klinicznym z docelowym poziomem glukozy wynoszącym 80-140 mg/dl na czczo i 80-180 mg/dl przed posiłkami. Podczas każdej wizyty badawczej rejestrowaliśmy aktualne dawki insuliny i masę ciała pacjenta, aby umożliwić obliczenie całkowitej dawki dziennej (jednostki/kg/dzień).

Anakinra Po włączeniu do badania wszyscy uczestnicy rozpoczęli przyjmowanie anakinry (Kineret; Amgen, Thousand Oaks, Kalifornia) w postaci codziennych wstrzyknięć podskórnych. Osoby ważące ponad 25 kg w momencie włączenia otrzymywały 100 mg na dobę, podczas gdy osoby ważące 25 kg lub mniej otrzymywały 50 mg na dobę. Anakinrę kontynuowano łącznie przez 28 dni bez modyfikacji dawki.

Autoprzeciwciała przeciwcukrzycowe Zgodnie ze standardowym protokołem wszyscy pacjenci zostali przebadani pod kątem przeciwciał przeciwko insulinie, receptorowi białkowej fosfatazy tyrozynowej typu N (antygen związany z insulinoma (IA-2)) i dekarboksylazie kwasu glutaminowego (ARUP Laboratories, Salt Lake City, UT). Wyniki tych badań zazwyczaj nie były dostępne w momencie włączenia do badania i dlatego nie były wykorzystywane jako kryteria przystąpienia do badania. Jednak wykluczyliśmy pacjentów z negatywnymi wynikami dla wszystkich trzech przeciwciał z dalszej analizy.

Obserwacyjne badania laboratoryjne Po zakończeniu terapii anakinrą (4-5 tygodni po postawieniu diagnozy) pobrano próbkę krwi i wysłano ją na ALT, AST, BUN, kreatyninę i CBC z różnicowaniem. Zgodnie ze standardowym protokołem u wszystkich pacjentów podczas wizyt w klinice 4-5 tygodni po rozpoznaniu, 4 miesiące po postawieniu diagnozy i 7 diagnoza.

Monitorowanie zdarzeń niepożądanych W ciągu 28 dni leczenia anakinrą personel badawczy co tydzień dzwonił do pacjentów w celu udokumentowania częstości występowania hipoglikemii i obecności wysypki, reakcji w miejscu wstrzyknięcia (obrzęk, rumień i ból w miejscu podania anakinry), bólów głowy, gorączki i wszelkich inne zdarzenia niepożądane. Po zakończeniu terapii anakinrą pacjenci byli oceniani pod kątem zdarzeń niepożądanych podczas każdej kolejnej wizyty w ramach badania.

Testy tolerancji posiłków mieszanych (MMTT) Testy MMTT zostały przeprowadzone w University of Texas Southwestern Medical Center Clinical Translational Research Center (CTRC). Pacjenci przeszli MMTT zasadniczo jak opisano (8) po 3-4 tygodniach od diagnozy i ponownie po 7 miesiącach od diagnozy. Analizy peptydu C przeprowadzono w laboratorium dr Philipa Raskina (UT Southwestern Medical Center, Dallas, TX).

Przetwarzanie próbek krwi za pomocą mikromacierzy Próbki krwi za pomocą mikromacierzy pobrano do probówek z EDTA (BD Vacutainer) w momencie włączenia do badania, 3-4 tygodnie po postawieniu diagnozy i po zakończeniu leczenia anakinrą. PBMC izolowano i przechowywano w temperaturze -80°C w ciągu 4 godzin od pobrania krwi. Komórki poddano lizie w buforze do lizy RLT zawierającym β-merkaptoetanol (Qiagen, Valencia, CA). Całkowity RNA ekstrahowano przy użyciu zestawu RNeasy® Mini Kit zgodnie z protokołem zalecanym przez producenta (Qiagen, Valencia, CA) i analizowano jak opisano powyżej.

Grupy kontrolne Ponieważ uczestnicy badania anakinra nie byli randomizowani, wykorzystaliśmy dwie różne wcześniej istniejące grupy kontrolne. Pacjenci z grupy kontrolnej A byli wcześniej zapisani do naszej instytucji na podstawie odrębnego, zatwierdzonego przez IRB protokołu w randomizowanym, kontrolowanym badaniu badającym wpływ początkowego wyboru dłużej działającej insuliny na szybkość utraty funkcji komórek beta. Pacjenci zostali włączeni podczas hospitalizacji z powodu diagnozy cukrzycy i losowo przydzieleni do grupy otrzymującej insulinę NPH lub insulinę bazową (glargine lub detemir). Opieka diabetologiczna i rutynowe wizyty w klinice, harmonogram i procedury testowania tolerancji posiłków mieszanych i analizy mikromacierzy były takie same jak w przypadku naszych pacjentów leczonych anakinrą. Grupa kontrolna A obejmuje wszystkich pacjentów w tym badaniu losowo przydzielonych do grupy otrzymującej insulinę bazową, z wyjątkiem pacjentów z ujemnym wynikiem autoprzeciwciał wyniki.

Osoby z grupy kontrolnej B zostały zidentyfikowane w przeglądzie wykresów wszystkich nowych rozpoznań cukrzycy od kwietnia 2008 do listopada 2009 u pacjentów w wieku 9-18 lat (w celu dopasowania zakresu dat rekrutacji i wieku pacjentów leczonych anakinrą). Pacjenci byli włączani do tej grupy kontrolnej, jeśli mieli co najmniej jedno pozytywne autoprzeciwciało i nie byli włączeni do badania anakinry. Zebraliśmy wiek, płeć, rasę / pochodzenie etniczne, wagę, wzrost i beta-hydroksymaślan w momencie diagnozy. Zebraliśmy również HbA1c i całkowitą dzienną dawkę insuliny (wyrażoną w jednostkach / kg / dzień) w momencie rozpoznania oraz podczas wizyt w klinice po 1 miesiącu, 4 miesiącach i 7 miesiącach po postawieniu diagnozy.

Podgrupa 10 z tych osób wyraziła zgodę na włączenie się do zatwierdzonego przez IRB badania, w którym pobrano krew do analizy mikromacierzy w momencie diagnozy i ponownie miesiąc po diagnozie. Procedury mikromacierzy były takie same, jak opisano powyżej dla osobników leczonych anakinrą.

Analiza statystyczna Zestawiono statystyki opisowe i przeprowadzono wszystkie analizy porównawcze przy użyciu wersji SAS 9.2 (Cary, Karolina Północna). Pole powierzchni peptydu C pod krzywą (AUC) obliczono dla każdego MMTT stosując metodę trapezoidalną. A1c dostosowane do dawki insuliny (IDAA1c) obliczono jak opisał Mortensen i in. glin. (9), IDAA1c = hemoglobina A1C (procent) + [4 × dawka insuliny (jednostki na kilogram na 24 h)]. Hemoglobina A1c i IDAA1c między grupami została porównana przy użyciu testów sumy rang Wilcoxona. Ponieważ całkowita dobowa dawka insuliny miała rozkład normalny, porównania między grupami przeprowadzono za pomocą standardowego testu t.