新たに診断された 1 型糖尿病におけるアナキンラによる抗炎症療法

1 型糖尿病 (T1D) は、膵臓のランゲルハンス島にあるインスリン産生ベータ細胞の自己免疫および自己炎症性破壊によって引き起こされます。 歴史的に、この状態の治療は、インスリン補充療法と食事の変更で構成されていました。 最近の研究では、新たに診断された 1 型糖尿病患者における免疫調節療法の潜在的な利点が、さらなる免疫介在性の損傷を防ぐために実証されています。 これまでのところ、T1D で調節不全の炎症誘発性サイトカインを標的とする薬剤を使用した完了した研究は不足しています。

炎症誘発性サイトカインであるインターロイキン-1β（IL-1β）をコードする遺伝子であるIL1Bは、健康な対照と比較して、新たにT1Dと診断された患者の末梢血単核細胞（PBMC）で有意に過剰発現しています。 糖尿病の病因におけるIL-1βの関与を支持する十分な先例があります。 特に、ヒトまたは動物の膵島またはインスリノーマ細胞株と IL-1β とのインキュベーションは、インスリン分泌を阻害し、ベータ細胞のアポトーシスを引き起こします。

さらに、IL-1受容体アンタゴニストタンパク質であるanakinraは、2型糖尿病患者の血糖コントロールとインスリン分泌能力を改善します.しかし、患者の疾患の経過を修正する際のIL-1βを標的とする薬剤の有効性に関するデータは発表されていません. T1Dで。 Anti-Interleukin-1 in Diabetes Action (AIDA) は、新たに 1 型糖尿病と診断された成人 160 人を対象としたアナキンラのランダム化プラセボ対照臨床試験です。 この治験は現在被験者募集中です。 Clinicaltrials.gov のレビュー は、新たに診断された T1D における IL-1 薬剤の他の 2 つの計画された試験を示しています。 将来の研究や臨床現場でこれらの薬の有効性を評価するには、治療効果を監視できるバイオマーカーを特定することが重要です。 ただし、私たちの知る限り、正常な PBMC で IL-1β によって誘導される遺伝子発現の変化のパターンは体系的に研究されておらず、検証研究の候補バイオマーカーを特定することは困難です。

この探索的研究では、in vitro と in vivo の両方のアプローチを使用して、新たに診断された T1D 患者の遺伝子発現の特徴的な変化のどれが IL-1β を介したものかを判断することを目的としました。 また、混合食事耐性試験（MMTT）中の血糖コントロール、インスリン投与、および曲線下のCペプチド面積に対するアナキンラ療法の短期コースの効果の大きさを決定しました。 最後に、新たに T1D と診断された小児および青年におけるアナキンラの忍容性を評価しました。

方法 in vitro 研究 末梢血単核細胞 (PBMC) の遺伝子発現に対する IL-1β の影響を調べるために、IRB 承認のプロトコルに従って 7 人の健康な成人ボランティアから血液サンプルを採取しました。

血清を分離します。 血液をＥＤＴＡチューブ（ＢＤ、Ｆｒａｎｋｌｉｎ Ｌａｋｅｓ、ＮＪ）に集め、２５００ｒｐｍで１５分間遠心分離した。 血漿層を総体積の５％に等しい局所トロンビン（５０００Ｕ／ｍｌ、Ｋｉｎｇ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ、ブリストル、テネシー州）で処理し、３８℃で２０分間インキュベートした。 得られた血塊を血清から除去し、廃棄した。

細胞培養。 ＰＢＭＣは、リンパ球分離培地（Ｍｅｄｉａｔｅｃｈ、Ｍａｎａｓｓａｓ、ＶＡ）を用いた遠心分離によって細胞画分から単離され、ＰＢＳ（Ｍｅｄｉａｔｅｃｈ、Ｍａｎａｓｓａｓ、ＶＡ）で洗浄された。 細胞を、10%ウシ胎児血清(Atlanta Biologicals、Lawrenceville、GA)、10%自己ヒト血清、5.5mMグルコース、100Uペニシリン、100 μg/ml ストレプトマイシン、50 μmol/l 2-メルカプトエタノール、および 5% HEPES。 IL-1β (最終濃度 15 ng/ml、Abcam、マサチューセッツ州ケンブリッジ)、または 9.3 μg/ml S100b (シグマ、ミズーリ州セントルイス) をいくつかのウェルに加えました。すべての実験条件を 3 連でプレーティングしました。 細胞は、5% CO2 雰囲気中、37°C​​ で 24 時間培養した後に回収されました。

RT-PCRによる検証。 ＲＮＡ－Ｓｔａｔ ６０（Ｔｅｌ－Ｔｅｓｔ、Ｆｒｉｅｎｄｓｗｏｏｄ、ＴＸ）を使用して全ＲＮＡを単離した。 High Capacity cDNA Reverse Transcription Kit (Applied Biosystems, Carlsbad, CA) を 750 ng の RNA と共に使用して、cDNA を作成しました。 ５μｌのｃＤＮＡサンプル、Ｒｏｃｈｅ ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ Ｐｒｏｂｅｓ ＭａｓｔｅｒキットおよびヒトＩＬ１Ｂプライマー（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を使用して、Ｒｏｃｈｅ ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ ４８０システムでリアルタイムＰＣＲを実施した。 ＲＮＡは、ＧＡＤＰＨを内部対照として使用してΔＣｔ値によって定量化した（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）。

マイクロアレイ分析。 さらなる分析のために、実験条件ごとに3つのサンプルをプールしました。 2 ～ 5 μg の全 RNA から、T7-dT(24) プロモーター配列を含む二本鎖 cDNA を、GeneChip® One-Cycle cDNA Synthesis Kits (Invitrogen、Santa Clara、CA) を使用して生成しました。 ｃＲＮＡの合成は、Ｉｌｌｕｍｉｎａ ＲＮＡ増幅キット（Ａｍｂｉｏｎ Ｉｎｃ、Ａｕｓｔｉｎ、ＴＸ）を使用する製造業者の指示に従って、ｉｎ ｖｉｔｒｏ転写、増幅および標識工程のために２００ｎｇのｃＤＮＡを使用した。 続いて、増幅されたビオチン標識 cRNA 1.5 µg を、標準プロトコルに従って Illumina Human HT-12 v3.0 Beadchip マイクロアレイにハイブリダイズさせました。 テキサス州ダラスのベイラー免疫学研究所で。

スライドは Illumina Beadstation 500 でスキャンし、データは Beadstudio ソフトウェアで処理しました。 各チップについて、生の強度データは、そのチップ上のすべての測定値の平均強度に正規化されました。 さらに分析するために、データを Genespring GX11 (Agilent) にインポートしました。 いずれかのグループのサンプルの少なくとも 50% で「存在する」または「限界」である場合、プローブ セットが選択されました。 外れ値を検出するために主成分分析が実行されました。 クラス比較は、Benjamini-Hochberg 誤検出率 (FDR) を使用して制御されたタイプ 1 エラー率で、対数変換後に t 検定を使用して実行されました。

インビボ研究 被験者。 この研究は、テキサス大学サウスウェスタン医療センターの治験審査委員会によって承認されました。 書面によるインフォームド コンセントは両親または法定後見人から得られ、参加の同意は 10 歳以上の被験者から得られました。 Children's Medical Center Dallas の 6 歳から 18 歳までの診断後 1 週間以内の 1 型糖尿病患者が適格でした。 除外基準には、全身または吸入コルチコステロイドまたはその他の免疫調節薬による治療、活動性感染症、マイコバクテリア病の病歴、妊娠または授乳、研究登録から90日以内の生ワクチンの使用、および重度の併存症（慢性腎臓病、心臓病など）が含まれます。失敗、または制御されていない高血圧)。 1 型糖尿病か 2 型糖尿病かが不明な患者は除外されました。

カルテから収集されたデータには、診断時の年齢、性別、人種/民族、体重、身長、ヘモグロビン A1c (HbA1c)、ベータ-ヒドロキシブチレートが含まれていました。 研究登録時に血液サンプルが採取されました。一部は、アラニンアミノトランスフェラーゼ（ALT）、アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ（AST）、血中尿素窒素（BUN）、クレアチニン、全血球計算（CBC）と鑑別検査、および月経中のすべての女性と月経中のすべての女性の血清妊娠検査を含む検査室をスクリーニングするために分析されました。年齢10歳。 さらに、マイクロ アレイ解析用に 20 mL を処理しました。

糖尿病ケア 診断時に、すべての被験者は、グラルギンとリスプロまたはアスパルトのいずれかによる基礎ボーラスインスリンレジメンに置かれました。 試験期間中、インスリンの投与量は、標準的な臨床プロトコルに従って、空腹時 80 ～ 140 mg/dL、食事前 80 ～ 180 mg/dL の目標グルコースに調整されました。 各研究訪問時に、被験者の現在のインスリン投与量と体重を記録して、1日の総投与量（単位/ kg /日）を計算できるようにしました。

アナキンラ 研究登録後、すべての被験者は毎日の皮下注射としてアナキンラ（Kineret; Amgen、カリフォルニア州サウザンドオークス）を開始しました。 登録時に体重が 25 kg を超える被験者は 1 日 100 mg を摂取し、体重が 25 kg 以下の被験者は 1 日 50 mg を摂取しました。 アナキンラは、用量調整なしで合計 28 日間継続されました。

糖尿病の自己抗体 標準プロトコルに従って、すべての患者は、インスリン、プロテインチロシンホスファターゼ受容体タイプ N (インスリン腫関連抗原 (IA-2))、およびグルタミン酸デカルボキシラーゼ (ARUP Laboratories、ソルトレイクシティ、ユタ州) に対する抗体について検査されました。 これらの研究の結果は、通常、研究登録時には入手できなかったため、研究登録の基準としては使用されませんでした。 ただし、3つの抗体すべてで陰性の結果が得られた患者は、さらなる分析から除外しました。

サーベイランス臨床検査 anakinra 治療の完了時 (診断後 4 ～ 5 週間)、血液サンプルが採取され、ALT、AST、BUN、クレアチニン、CBC と鑑別のために送られました。 標準プロトコルに従って、すべての被験者は、ポイントオブケアヘモグロビンA1c（DCA Vantage Analyzer、Siemens Healthcare Diagnostics、ディアフィールド、イリノイ州）と毛細血管ブドウ糖を、診断後4〜5週間、診断後4か月、および診断後7か月の診療所で検査されました。診断。

有害事象のモニタリング アナキンラ療法の 28 日間、研究担当者は毎週被験者に電話をかけ、低血糖の頻度と発疹、注射部位反応（腫れ、紅斑、アナキンラ投与部位の痛み）、頭痛、発熱などを記録しました。その他の有害事象。 アナキンラ治療の完了後、患者はその後の各研究訪問で有害事象について評価されました。

混合食事耐性試験 (MMTT) MMTT は、テキサス大学サウスウェスタン医療センター臨床トランスレーショナル研究センター (CTRC) で実施されました。 被験体は、本質的に記載されているように（8）、診断後3～4週間でMMTTを受け、診断後7ヶ月で再度受けた。 C-ペプチド分析は、Dr. Philip Raskin (UT Southwestern Medical Center, Dallas, TX) の研究室で実施されました。

マイクロアレイ血液サンプルの処理 マイクロアレイ血液サンプルは、研究登録時、診断の 3～4 週間後、およびアナキンラ療法の完了時に、EDTA チューブ (BD Vacutainer) に収集されました。 ＰＢＭＣを単離し、採血から４時間以内に－８０℃で保存した。 β－メルカプトエタノール（Ｑｉａｇｅｎ、Ｖａｌｅｎｃｉａ、ＣＡ）を含有するＲＬＴ溶解緩衝液中で細胞を溶解した。 全 RNA を RNeasy® Mini Kit を使用して製造元の推奨プロトコル (Qiagen、Valencia、CA) に従って抽出し、上記のように分析しました。

対照群 アナキンラ研究の被験者は無作為化されていないため、2 つの異なる既存の対照群を使用しました。 対照群Aの被験者は、ベータ細胞機能の喪失率に対する長時間作用型インスリンの最初の選択の影響を調べる無作為対照試験で、別のIRB承認プロトコルの下で以前に当施設に登録されていました. 被験者は、糖尿病診断のための入院中に登録され、NPH または基礎インスリン (グラルギンまたはデテミル) を受けるように無作為化されました。 糖尿病ケアと定期的な診療所訪問、混合食事耐性試験のスケジュールと手順、およびマイクロアレイ分析は、アナキンラ治療を受けた被験者と同じでした..対照群Aには、自己抗体が陰性の患者を除いて、基礎インスリンを受け取るように無作為化されたその研究のすべての患者が含まれます.結果。

対照群 B の被験者は、2008 年 4 月から 2009 年 11 月までの 9 ～ 18 歳の患者のすべての新しい糖尿病診断のチャート レビューで特定されました (募集の日付範囲とアナキンラ治療被験者の年齢を一致させるため)。 被験者が少なくとも 1 つの陽性自己抗体を持ち、anakinra 研究に登録されていない場合、被験者はこの対照群に含まれました。 診断時に、年齢、性別、人種/民族、体重、身長、β-ヒドロキシブチレートを収集しました。 また、診断時および診断後 1 か月、4 か月、および 7 か月の来院時に、HbA1c および 1 日あたりの総インスリン投与量 (単位/kg/日で表される) を収集しました。

これらの被験者の 10 人のサブセットは、IRB が承認した研究に登録することに同意しました。この研究では、診断時と診断の 1 か月後にマイクロアレイ分析のために血液が採取されました。 マイクロアレイの手順は、アナキンラで治療された被験者について上記で説明したものと同じでした。

統計分析 記述統計を編集し、すべての比較分析は、SAS バージョン 9.2 (Cary, NC) を使用して実行しました。 台形法を使用して、各 MMTT について C ペプチドの曲線下面積 (AUC) を計算しました。 アル。 (9)、IDAA1c = ヘモグロビン A1C (パーセント) + [4 × インスリン投与量 (24 時間あたりのキログラムあたりの単位)]。 グループ間のヘモグロビン A1c と IDAA1c は、ウィルコクソン順位和検定を使用して比較されました。 1 日あたりの総インスリン投与量は正規分布していたので、標準的な t 検定によってグループ間の比較を行いました。