Thérapie anti-inflammatoire avec Anakinra dans le diabète de type 1 nouvellement diagnostiqué

Le diabète sucré de type 1 (DT1) est causé par la destruction auto-immune et auto-inflammatoire des cellules bêta productrices d'insuline dans les îlots pancréatiques de Langerhans. Historiquement, le traitement de cette affection consistait en une thérapie de remplacement de l'insuline et en une modification du régime alimentaire. Des études récentes ont démontré les avantages potentiels de la thérapie immunomodulatrice chez les patients atteints de DT1 nouvellement diagnostiqué pour prévenir d'autres dommages à médiation immunitaire. Jusqu'à présent, il y a eu peu de recherches achevées utilisant des agents ciblant les cytokines pro-inflammatoires dérégulées dans le DT1.

IL1B, le gène codant pour la cytokine pro-inflammatoire interleukine-1β (IL-1β) est significativement surexprimé dans les cellules mononucléaires du sang périphérique (PBMC) chez les patients atteints de DT1 nouvellement diagnostiqué par rapport aux témoins sains. Il existe de nombreux précédents pour soutenir l'implication de l'IL-1β dans la pathogenèse du diabète. En particulier, l'incubation d'îlots humains ou animaux ou de lignées cellulaires d'insulinome avec l'IL-1β inhibe la sécrétion d'insuline et conduit à l'apoptose des cellules bêta.

De plus, la protéine antagoniste des récepteurs de l'IL-1, l'anakinra, améliore le contrôle glycémique et la capacité de sécrétion d'insuline chez les patients atteints de diabète de type 2. Cependant, aucune donnée n'a été publiée concernant l'efficacité des agents ciblant l'IL-1β pour modifier l'évolution de la maladie chez les patients. avec DT1. Anti-Interleukin-1 in Diabetes Action (AIDA) est un essai clinique randomisé et contrôlé par placebo sur l'anakinra chez 160 adultes atteints de diabète de type 1 nouvellement diagnostiqué. Cet essai recrute actuellement des sujets. Examen declinicaltrials.gov démontre deux autres essais prévus d'agents IL-1 dans le DT1 nouvellement diagnostiqué, l'un utilisant le canakinumab, un anticorps monoclonal dirigé contre l'IL-1β, et l'autre utilisant le rilonacept, un piège à cytokines ciblant l'IL-1β. Pour évaluer l'efficacité de ces médicaments dans les études futures et dans la pratique clinique, il sera utile d'identifier des biomarqueurs qui nous permettront de surveiller leurs effets thérapeutiques. Cependant, à notre connaissance, le schéma des modifications de l'expression génique induites par l'IL-1β dans les PBMC normaux n'a pas été systématiquement étudié, ce qui rend difficile l'identification de biomarqueurs candidats pour les études de validation.

Dans cette étude exploratoire, nous avons cherché à déterminer lesquels des changements caractéristiques de l'expression génique chez les patients atteints de DT1 nouvellement diagnostiqué sont médiés par l'IL-1β, en utilisant à la fois des approches in vitro et in vivo. Nous avons également déterminé l'ampleur de l'effet d'un traitement de courte durée par l'anakinra sur le contrôle glycémique, le dosage de l'insuline et la zone du peptide C sous la courbe lors des tests de tolérance aux repas mixtes (MMTT). Enfin, nous avons évalué la tolérance de l'anakinra chez les enfants et les adolescents atteints de DT1 nouvellement diagnostiqué.

Méthodes Études in vitro Pour déterminer les effets de l'IL-1β sur l'expression génique dans les cellules mononucléaires du sang périphérique (PBMC), des échantillons de sang ont été prélevés sur 7 volontaires adultes sains selon un protocole approuvé par l'IRB.

Sérum isolant. Le sang a été recueilli dans des tubes EDTA (BD, Franklin Lakes, NJ) et centrifugé à 2500 tr/min pendant 15 minutes. La couche de plasma a été traitée avec de la thrombine topique (5000 U/ml, King Pharmaceuticals, Bristol, TN) équivalant à 5 % du volume total et incubée à 38° pendant 20 minutes. Le caillot résultant a été retiré du sérum et jeté.

Culture de cellules. Les PBMC ont été isolés de la fraction cellulaire par centrifugation en utilisant un milieu de séparation des lymphocytes (Mediatech, Manassas, VA) et lavés avec du PBS (Mediatech, Manassas, VA). Les cellules ont été étalées à raison de 3 x 106 par puits dans des plaques à 6 puits dans du RPMI 1640 (Mediatech) additionné de 10 % de sérum bovin fœtal (Atlanta Biologicals, Lawrenceville, GA), 10 % de sérum humain autologue, 5,5 mM de glucose, 100 U de pénicilline, 100 µg/ml de streptomycine, 50 µmol/l de 2-mercaptoéthanol et 5 % d'HEPES. IL-1β (concentration finale de 15 ng/ml, Abcam, Cambridge, MA) ou 9,3 µg/ml de S100b (Sigma, St. Louis, MO) ont été ajoutés à certains puits. Toutes les conditions expérimentales ont été plaquées en triple. Les cellules ont été collectées après 24 heures d'incubation à 37°C dans une atmosphère à 5% de CO2.

Validation par RT-PCR. L'ARN total a été isolé à l'aide de RNA-Stat 60 (Tel-Test, Friendswood, TX). Le kit de transcription inverse d'ADNc haute capacité (Applied Biosystems, Carlsbad, CA) a été utilisé avec 750 ng d'ARN pour créer de l'ADNc. Une PCR en temps réel a été réalisée sur le système Roche LightCycler 480 en utilisant 5 ul de l'échantillon d'ADNc, le kit Roche LightCycler Probes Master et des amorces IL1B humaines (Applied Biosystems). L'ARN a été quantifié par les valeurs delta Ct en utilisant GADPH comme contrôle interne (Applied Biosystems).

Analyse de puces à ADN. Des échantillons en triple pour chaque condition expérimentale ont été regroupés pour une analyse plus approfondie. À partir de 2 à 5 µg d'ARN total, de l'ADNc double brin contenant la séquence du promoteur T7-dT(24) a été généré à l'aide des kits de synthèse d'ADNc à cycle unique GeneChip® (Invitrogen, Santa Clara, CA). La synthèse de l'ARNc a utilisé 200 ng d'ADNc pour les étapes de transcription, d'amplification et de marquage in vitro conformément aux instructions du fabricant en utilisant le kit d'amplification d'ARN Illumina (Ambion Inc, Austin, TX). 1,5 µg d'ARNc amplifié marqué à la biotine ont ensuite été hybridés avec des puces à billes Illumina Human HT-12 v3.0 conformément aux protocoles standard. au Baylor Institute for Immunology Research, Dallas, TX.

Les lames ont été numérisées sur un Illumina Beadstation 500 et les données traitées avec le logiciel Beadstudio. Pour chaque puce, les données d'intensité brutes ont été normalisées à l'intensité moyenne de toutes les mesures sur cette puce. Les données ont été importées dans Genespring GX11 (Agilent) pour une analyse plus approfondie. Les ensembles de sondes ont été sélectionnés s'ils étaient « présents » ou « marginaux » dans au moins 50 % des échantillons de n'importe quel groupe. Une analyse en composantes principales a été effectuée pour détecter les valeurs aberrantes. Les comparaisons de classe ont été effectuées à l'aide de tests t après transformation log avec le taux d'erreur de type 1 contrôlé à l'aide des taux de fausse découverte Benjamini-Hochberg (FDR).

Études in vivo Sujets. L'étude a été approuvée par l'Institutional Review Board de l'Université du Texas Southwestern Medical Center. Un consentement éclairé écrit a été obtenu des parents ou des tuteurs légaux, et le consentement à la participation a été obtenu des sujets âgés de 10 ans et plus. Les patients du Children's Medical Center Dallas âgés de 6 à 18 ans atteints de diabète de type 1 dans la semaine suivant le diagnostic étaient éligibles. Les critères d'exclusion comprenaient un traitement par des corticostéroïdes systémiques ou inhalés ou tout autre médicament immunomodulateur, une infection active, des antécédents de maladie mycobactérienne, une grossesse ou un allaitement, l'utilisation d'un vaccin vivant dans les 90 jours suivant l'inscription à l'étude et des comorbidités graves (telles qu'une maladie rénale chronique, une maladie cardiaque insuffisance cardiaque ou hypertension non contrôlée). Les patients ont été exclus s'il n'était pas clair s'ils avaient un diabète de type 1 ou de type 2.

Les données recueillies à partir des dossiers médicaux comprenaient l'âge, le sexe, la race/ethnicité, le poids, la taille, l'hémoglobine A1c (HbA1c) et le bêta-hydroxybutyrate au moment du diagnostic. Un échantillon de sang a été obtenu à l'entrée dans l'étude ; une partie a été analysée pour les laboratoires de dépistage, y compris l'alanine aminotransférase (ALT), l'aspartate aminotransférase (AST), l'azote uréique du sang (BUN), la créatinine, la numération globulaire complète (CBC) avec différentiel et le test de grossesse sérique pour toutes les femmes menstruées et toute femme sur âge 10 ans. De plus, 20 ml ont été traités pour l'analyse de puces à ADN.

Soins du diabète Au moment du diagnostic, tous les sujets ont été placés sous insuline basale-bolus avec glargine et soit lispro, soit asparte. Pendant la durée de l'étude, les doses d'insuline ont été ajustées selon le protocole clinique standard avec une glycémie cible de 80 à 140 mg/dL à jeun et de 80 à 180 mg/dL avant les repas. À chaque visite d'étude, nous avons enregistré les doses d'insuline et le poids actuels du sujet pour permettre le calcul de la dose quotidienne totale (unités/kg/jour).

Anakinra Après l'inscription à l'étude, tous les sujets ont commencé l'anakinra (Kineret ; Amgen, Thousand Oaks, CA) sous forme d'injection quotidienne sous-cutanée. Les sujets pesant plus de 25 kg au moment de l'inscription ont reçu 100 mg par jour tandis que ceux pesant 25 kg ou moins ont reçu 50 mg par jour. Anakinra a été poursuivi pendant 28 jours au total sans ajustement posologique.

Auto-anticorps antidiabétiques Selon le protocole standard, tous les patients ont été testés pour les anticorps dirigés contre l'insuline, le récepteur de la protéine tyrosine phosphatase de type N (antigène associé à l'insulinome (IA-2)) et l'acide glutamique décarboxylase (ARUP Laboratories, Salt Lake City, UT). Les résultats de ces études n'étaient généralement pas disponibles au moment de l'inscription à l'étude et n'ont donc pas été utilisés comme critères d'admission à l'étude. Cependant, nous avons exclu les patients avec des résultats négatifs pour les trois anticorps d'une analyse plus approfondie.

Tests de laboratoire de surveillance À la fin du traitement par anakinra (4 à 5 semaines après le diagnostic), un échantillon de sang a été prélevé et envoyé pour ALT, AST, BUN, créatinine et CBC avec différentiel. Selon le protocole standard, tous les sujets ont subi un test d'hémoglobine A1c au point de service (DCA Vantage Analyzer, Siemens Healthcare Diagnostics, Deerfield, IL) et de glucose capillaire lors de visites à la clinique 4 à 5 semaines après le diagnostic, 4 mois après le diagnostic et 7 mois après diagnostic.

Surveillance des événements indésirables Au cours des 28 jours de traitement par l'anakinra, le personnel de l'étude a appelé les sujets chaque semaine pour documenter la fréquence des hypoglycémies et la présence d'éruptions cutanées, les réactions au site d'injection (gonflement, érythème et douleur au site d'administration de l'anakinra), les maux de tête, la fièvre et tout autres événements indésirables. Après la fin du traitement par l'anakinra, les patients ont été évalués pour les événements indésirables lors de chaque visite d'étude ultérieure.

Tests de tolérance aux repas mixtes (MMTT) Les MMTT ont été menés au Centre de recherche clinique translationnelle (CTRC) du Southwestern Medical Center de l'Université du Texas. Les sujets ont subi des MMTT essentiellement comme décrit (8) à 3-4 semaines après le diagnostic et à nouveau à 7 mois après le diagnostic. Les analyses du peptide C ont été effectuées dans le laboratoire du Dr Philip Raskin (UT Southwestern Medical Center, Dallas, TX).

Traitement des échantillons de sang par micropuce Des échantillons de sang par micropuce ont été prélevés dans des tubes EDTA (BD Vacutainer) lors de l'inscription à l'étude, 3 à 4 semaines après le diagnostic et à la fin du traitement par l'anakinra. Les PBMC ont été isolés et conservés à -80°C dans les 4 heures suivant le prélèvement sanguin. Les cellules ont été lysées dans un tampon de lyse RLT contenant du β-mercaptoéthanol (Qiagen, Valencia, CA). L'ARN total a été extrait à l'aide du kit RNeasy® Mini selon le protocole recommandé par le fabricant (Qiagen, Valencia, CA) et analysé comme décrit ci-dessus.

Groupes témoins Étant donné que les sujets de l'étude sur l'anakinra n'étaient pas randomisés, nous avons utilisé deux groupes témoins préexistants différents. Les sujets du groupe témoin A étaient auparavant inscrits dans notre établissement dans le cadre d'un protocole distinct approuvé par l'IRB dans un essai contrôlé randomisé examinant l'effet du choix initial d'insuline à action prolongée sur le taux de perte de la fonction des cellules bêta. Les sujets ont été recrutés pendant leur hospitalisation pour un diagnostic de diabète et randomisés pour recevoir soit du NPH, soit de l'insuline basale (glargine ou détémir). Les soins du diabète et les visites de routine à la clinique, le calendrier et les procédures pour les tests de tolérance aux repas mixtes et l'analyse des microréseaux étaient les mêmes que pour nos sujets traités à l'anakinra. résultats.

Les sujets du groupe témoin B ont été identifiés dans un examen des dossiers de tous les nouveaux diagnostics de diabète d'avril 2008 à novembre 2009 chez des patients âgés de 9 à 18 ans (pour correspondre à la plage de dates de recrutement et à l'âge des sujets traités à l'anakinra). Les sujets ont été inclus dans ce groupe témoin s'ils avaient au moins un auto-anticorps positif et n'étaient pas inscrits à l'étude sur l'anakinra. Nous avons recueilli l'âge, le sexe, la race/l'origine ethnique, le poids, la taille et le bêta-hydroxybutyrate au moment du diagnostic. Nous avons également recueilli l'HbA1c et la dose quotidienne totale d'insuline (exprimée en unités/kg/jour) au moment du diagnostic et pour les visites à la clinique à 1 mois, 4 mois et 7 mois après le diagnostic.

Un sous-ensemble de 10 de ces sujets a consenti à s'inscrire à une étude approuvée par l'IRB dans laquelle du sang a été prélevé pour une analyse par puce à ADN au moment du diagnostic et à nouveau 1 mois après le diagnostic. Les procédures de microréseau étaient les mêmes que celles décrites ci-dessus pour les sujets traités à l'anakinra.

Analyse statistique Des statistiques descriptives ont été compilées et toutes les analyses comparatives effectuées à l'aide de SAS version 9.2 (Cary, NC). L'aire du peptide C sous la courbe (AUC) a été calculée pour chaque MMTT en utilisant la méthode trapézoïdale. L'A1c ajusté à la dose d'insuline (IDAA1c) a été calculé comme indiqué par Mortensen, et. Al. (9), IDAA1c = hémoglobine A1C (pourcentage) + [4 × dose d'insuline (unités par kilogramme par 24 h)]. L'hémoglobine A1c et IDAA1c entre les groupes ont été comparées à l'aide des tests de somme des rangs de Wilcoxon. Étant donné que la dose quotidienne totale d'insuline était normalement distribuée, les comparaisons entre les groupes ont été effectuées par un test t standard.