阿那白滞素抗炎治疗新诊断的 1 型糖尿病

1 型糖尿病 (T1D) 是由朗格汉斯胰岛中产生胰岛素的 β 细胞的自身免疫和自身炎症破坏引起的。 从历史上看，这种情况的治疗包括胰岛素替代疗法和饮食调整。 最近的研究表明，免疫调节疗法对新诊断的 T1D 患者有潜在益处，可防止进一步的免疫介导损伤。 到目前为止，使用靶向 T1D 中失调的促炎细胞因子的药物的完整研究很少。

IL1B 是编码促炎细胞因子白细胞介素 1β (IL-1β) 的基因，与健康对照相比，在新诊断的 T1D 患者的外周血单核细胞 (PBMC) 中显着过表达。 有充分的先例支持 IL-1β 参与糖尿病的发病机制。 特别是，用 IL-1β 孵育人或动物胰岛或胰岛素瘤细胞系会抑制胰岛素分泌并导致 β 细胞凋亡。

此外，IL-1 受体拮抗剂蛋白阿那白滞素可改善 2 型糖尿病患者的血糖控制和胰岛素分泌能力。但是，关于靶向 IL-1β 的药物在改变患者病程方面的疗效，尚未发表任何数据患有 T1D。 Anti-Interleukin-1 in Diabetes Action (AIDA) 是一项针对阿那白滞素的随机、安慰剂对照临床试验，受试者为 160 名新诊断为 1 型糖尿病的成年人。 该试验目前正在招募受试者。 审查 clinicaltrials.gov 展示了另外两项 IL-1 药物在新诊断的 T1D 中的计划试验，一项使用 canakinumab，一种针对 IL-1β 的单克隆抗体，另一项使用 rilonacept，一种靶向 IL-1β 的细胞因子陷阱。 为了评估这些药物在未来研究和临床实践中的有效性，确定允许我们监测其治疗效果的生物标志物将很有价值。 然而，据我们所知，正常 PBMC 中 IL-1β 诱导的基因表达变化模式尚未得到系统研究，因此难以确定用于验证研究的候选生物标志物。

在这项探索性研究中，我们旨在使用体外和体内方法确定新诊断的 T1D 患者基因表达的哪些特征性变化是 IL-1β 介导的。 我们还确定了阿那白滞素短期疗程对血糖控制、胰岛素剂量和混合膳食耐受性测试 (MMTT) 期间 C 肽曲线下面积的影响大小。 最后，我们评估了新诊断为 T1D 的儿童和青少年对阿那白滞素的耐受性。

方法 体外研究 为了确定 IL-1β 对外周血单核细胞 (PBMC) 中基因表达的影响，根据 IRB 批准的方案从 7 名健康成年志愿者中采集血样。

隔离血清。 将血液收集在 EDTA 管（BD，Franklin Lakes，NJ）中并以 2500 rpm 离心 15 分钟。 血浆层用相当于总体积 5% 的局部凝血酶（5000 U/ml，King Pharmaceuticals，Bristol，TN）处理，并在 38° 下孵育 20 分钟。 从血清中取出所得凝块并丢弃。

细胞培养。 通过使用淋巴细胞分离培养基 (Mediatech, Manassas, VA) 离心从细胞部分分离 PBMC，并用 PBS (Mediatech, Manassas, VA) 洗涤。 将细胞以每孔 3 x 106 个接种在 RPMI 1640 (Mediatech) 的 6 孔板中，补充有 10% 胎牛血清（Atlanta Biologicals, Lawrenceville, GA）、10% 自体人血清、5.5 mM 葡萄糖、100 U 青霉素、100 µg/ml 链霉素、50 µmol/l 2-巯基乙醇和 5% HEPES。 将 IL-1β（终浓度为 15 ng/ml，Abcam，Cambridge，MA）或 9.3 µg/ml S100b（Sigma，St. Louis，MO）添加到一些孔中，所有实验条件均一式三份铺板。 在 5% CO2 气氛中于 37°C 孵育 24 小时后收集细胞。

通过 RT-PCR 验证。 使用 RNA-Stat 60 (Tel-Test, Friendswood, TX) 分离总 RNA。 High Capacity cDNA Reverse Transcription Kit (Applied Biosystems, Carlsbad, CA) 与 750 ng RNA 一起使用以产生 cDNA。 使用 5 ul cDNA 样品、Roche LightCycler Probes Master 试剂盒和人 IL1B 引物（Applied Biosystems）在 Roche LightCycler 480 系统上进行实时 PCR。 使用 GADPH 作为内部对照（Applied Biosystems）通过 delta Ct 值对 RNA 进行定量。

微阵列分析。 汇集每个实验条件的一式三份样品以供进一步分析。 使用 GeneChip® One-Cycle cDNA 合成试剂盒（Invitrogen，Santa Clara，CA）从 2-5 µg 总 RNA 中生成含有 T7-dT(24) 启动子序列的双链 cDNA。 根据制造商的说明使用 Illumina RNA 扩增试剂盒（Ambion Inc, Austin, TX），cRNA 的合成使用 200ng cDNA 进行体外转录、扩增和标记步骤。 根据标准方案，1.5 µg 扩增的生物素标记的 cRNA 随后与 Illumina Human HT-12 v3.0 Beadchip 微阵列杂交。 在德克萨斯州达拉斯的贝勒免疫学研究所。

在 Illumina Beadstation 500 上扫描载玻片，并使用 Beadstudio 软件处理数据。 对于每个芯片，原始强度数据被标准化为该芯片上所有测量的平均强度。 将数据导入 Genespring GX11（安捷伦）进行进一步分析。 如果在任何组中至少 50% 的样本中“存在”或“边缘”，则选择探针组。 执行主成分分析以检测异常值。 在对数转换后使用 t 检验进行类别比较，使用 Benjamini-Hochberg 错误发现率 (FDR) 控制 1 类错误率。

体内研究对象。 该研究得到德克萨斯大学西南医学中心机构审查委员会的批准。 从父母或法定监护人处获得书面知情同意书，并从 10 岁及以上的受试者处获得参与同意书。 达拉斯儿童医疗中心年龄在 6 至 18 岁之间且诊断后一周内患有 1 型糖尿病的患者符合条件。 排除标准包括全身性或吸入性皮质类固醇或任何其他免疫调节药物治疗、活动性感染、分枝杆菌病史、怀孕或哺乳、在研究登记后 90 天内使用活疫苗以及严重合并症（如慢性肾病、心脏病失败，或不受控制的高血压）。 如果不清楚患者是否患有 1 型或 2 型糖尿病，则将患者排除在外。

从医疗图表中收集的数据包括诊断时的年龄、性别、种族/民族、体重、身高、血红蛋白 A1c (HbA1c) 和 β-羟基丁酸盐。 在研究开始时获得了血液样本；分析了一部分用于筛选实验室，包括丙氨酸氨基转移酶 (ALT)、天冬氨酸氨基转移酶 (AST)、血尿素氮 (BUN)、肌酸酐、全血细胞计数 (CBC) 和分类，以及所有月经期女性和任何月经期以上女性的血清妊娠试验10岁。 此外，还处理了 20 mL 用于微阵列分析。

糖尿病护理 在诊断时，所有受试者都接受了甘精胰岛素和赖脯胰岛素或门冬胰岛素的基础推注胰岛素治疗方案。 在研究期间，根据标准临床方案调整胰岛素剂量，目标葡萄糖为空腹 80-140 mg/dL 和餐前 80-180 mg/dL。 在每次研究访问中，我们记录了受试者当前的胰岛素剂量和体重，以便计算每日总剂量（单位/千克/天）。

阿那白滞素 在研究入组后，所有受试者开始每日皮下注射阿那白滞素（Kineret；Amgen，Thousand Oaks，CA）。 入组时体重超过 25 公斤的受试者每天接受 100 毫克，而体重 25 公斤或以下的受试者每天接受 50 毫克。 阿那白滞素连续服用 28 天，没有调整剂量。

糖尿病自身抗体 根据标准方案，对所有患者进行了胰岛素、N 型蛋白酪氨酸磷酸酶受体（胰岛素瘤相关抗原 (IA-2)）和谷氨酸脱羧酶（ARUP 实验室，犹他州盐湖城）的抗体检测。 这些研究的结果通常在研究登记时不可获得，因此不被用作研究进入的标准。 但是，我们将所有三种抗体的结果均为阴性的患者排除在进一步分析之外。

监测实验室测试 在完成阿那白滞素治疗后（诊断后 4-5 周），采集血样并送去检测 ALT、AST、BUN、肌酐和 CBC 以及分类。 根据标准方案，所有受试者都在诊断后 4-5 周、诊断后 4 个月和诊断后 7 个月进行了床旁血红蛋白 A1c（DCA Vantage Analyzer，Siemens Healthcare Diagnostics，Deerfield，IL）和毛细血管葡萄糖测试诊断。

不良事件监测 在阿那白滞素治疗的 28 天期间，研究人员每周打电话给受试者以记录低血糖的频率和皮疹、注射部位反应（阿那白滞素给药部位的肿胀、红斑和疼痛）、头痛、发烧和任何其他不良事件。 阿那白滞素治疗完成后，在随后的每次研究访问中评估患者的不良事件。

混合膳食耐受性测试 (MMTT) MMTT 在德克萨斯大学西南医学中心临床转化研究中心 (CTRC) 进行。 受试者在诊断后 3-4 周和在诊断后 7 个月再次进行 MMTT，基本上如 (8) 所述。 C 肽分析在 Philip Raskin 博士（UT 西南医学中心，达拉斯，德克萨斯州）的实验室进行。

微阵列血样处理 在研究登记时、诊断后 3-4 周和阿那白滞素治疗完成后，将微阵列血样收集在 EDTA 管 (BD Vacutainer) 中。 PBMC 在抽血后 4 小时内分离并储存在 -80°C 下。 在含有 β-巯基乙醇的 RLT 裂解缓冲液（Qiagen，Valencia，CA）中裂解细胞。 根据制造商推荐的方案（Qiagen，Valencia，CA）使用 RNeasy® Mini Kit 提取总 RNA，并如上所述进行分析。

对照组 因为阿那白滞素研究中的受试者不是随机的，我们使用了两个不同的预先存在的对照组。 对照组 A 中的受试者先前是根据 IRB 批准的单独方案在我们机构登记的一项随机对照试验，该试验检验了初始选择长效胰岛素对 β 细胞功能丧失率的影响。 受试者在因糖尿病诊断住院期间被纳入，并随机接受 NPH 或基础胰岛素（甘精胰岛素或地特胰岛素）。 糖尿病护理和常规门诊就诊、混合膳食耐受性测试和微阵列分析的时间表和程序与我们的阿那白滞素治疗受试者相同。对照组 A 包括该研究中随机接受基础胰岛素治疗的所有患者，自身抗体阴性的患者除外结果。

对照组 B 中的受试者是在 2008 年 4 月至 2009 年 11 月所有新诊断糖尿病患者的图表审查中确定的，患者年龄为 9-18 岁（以匹配招募日期范围和阿那白滞素治疗受试者的年龄）。 如果受试者具有至少一种阳性自身抗体并且未参加阿那白滞素研究，则受试者被包括在该对照组中。 我们在诊断时收集了年龄、性别、种族/民族、体重、身高和 β-羟基丁酸。 我们还在诊断时以及诊断后 1 个月、4 个月和 7 个月的门诊就诊时收集了 HbA1c 和每日总胰岛素剂量（表示为单位/kg/天）。

这些受试者中有 10 人同意参加一项 IRB 批准的研究，该研究在诊断时和诊断后 1 个月再次抽血进行微阵列分析。 微阵列程序与上述阿那白滞素治疗对象相同。

统计分析 编制描述性统计数据，并使用 SAS 9.2 版（北卡罗来纳州卡里）进行所有比较分析。 使用梯形法计算每个 MMTT 的 C 肽曲线下面积 (AUC)。胰岛素剂量调整的 A1c (IDAA1c) 的计算方法如 Mortensen 等人所述。 阿尔。 (9)、IDAA1c=血红蛋白A1C(百分比)+[4×胰岛素剂量(每公斤每24小时单位数)]。 使用 Wilcoxon 秩和检验比较组间的血红蛋白 A1c 和 IDAA1c。 由于每日总胰岛素剂量呈正态分布，因此通过标准 t 检验进行组间比较。