Gyulladáscsökkentő terápia Anakinrával az újonnan diagnosztizált 1-es típusú cukorbetegségben

Az 1-es típusú cukorbetegséget (T1D) az inzulintermelő béta-sejtek autoimmun és autoinflammatorikus pusztulása okozza a hasnyálmirigy Langerhans szigetein. A történelem során ennek az állapotnak a kezelése inzulinpótló terápiából és étrend-módosításból állt. A közelmúltban végzett vizsgálatok kimutatták, hogy az újonnan diagnosztizált T1D-ben szenvedő betegek immunmoduláló terápiája milyen előnyökkel jár a további immunmediált károsodások megelőzésében. Eddig kevés olyan befejezett kutatás volt, amely olyan ágenseket használ, amelyek a T1D-ben szabályozott gyulladást elősegítő citokineket céloznak meg.

Az IL1B, a proinflammatorikus citokint, az interleukin-1β-t (IL-1β) kódoló gén szignifikánsan túltermelődik a perifériás vér mononukleáris sejtjeiben (PBMC) újonnan diagnosztizált T1D-ben szenvedő betegekben az egészséges kontrollokhoz képest. Számos precedens létezik az IL-1β részvételére a cukorbetegség patogenezisében. Különösen az emberi vagy állati szigetek vagy inzulinóma sejtvonalak IL-1β-val való inkubálása gátolja az inzulinszekréciót, és a béta-sejtek apoptózisához vezet.

Ezenkívül az IL-1 receptor antagonista fehérje, az anakinra javítja a glikémiás kontrollt és az inzulinszekréciós kapacitást 2-es típusú cukorbetegségben szenvedő betegeknél. Azonban nem publikáltak adatokat az IL-1β-t célzó szerek hatékonyságáról a betegség lefolyásának módosításában. T1D-vel. Az Anti-Interleukin-1 in Diabetes Action (AIDA) egy randomizált, placebo-kontrollos klinikai vizsgálat anakinrával 160, újonnan diagnosztizált 1-es típusú cukorbetegségben szenvedő felnőtt bevonásával. Ez a próba jelenleg alanyokat toboroz. A klinikai vizsgálatok áttekintése.gov két másik tervezett IL-1 ágens vizsgálatot mutat be újonnan diagnosztizált T1D-ben, az egyikben kanakinumabot, egy IL-1β-ra irányított monoklonális antitestet, a másikban pedig rilonaceptet, egy IL-1β-t célzó citokincsapdát alkalmaztak. E gyógyszerek hatékonyságának értékeléséhez a jövőbeni vizsgálatokban és a klinikai gyakorlatban értékes lesz olyan biomarkerek azonosítása, amelyek lehetővé teszik terápiás hatásuk nyomon követését. Legjobb tudomásunk szerint azonban a normál PBMC-ben az IL-1β által kiváltott génexpresszió változásainak mintázatát nem vizsgálták szisztematikusan, ami megnehezíti a jelölt biomarkerek azonosítását a validációs vizsgálatokhoz.

Ebben a feltáró vizsgálatban arra törekedtünk, hogy meghatározzuk, hogy az újonnan diagnosztizált T1D-ben szenvedő betegek génexpressziójában bekövetkező jellegzetes változások közül melyek az IL-1β-mediáltak, mind in vitro, mind in vivo megközelítésekkel. Meghatároztuk egy rövid anakinra terápia hatását a glikémiás kontrollra, az inzulin adagolására és a C-peptid görbe alatti területére a vegyes étkezési tolerancia teszt (MMTT) során. Végül értékeltük az anakinra tolerálhatóságát újonnan diagnosztizált T1D-vel rendelkező gyermekeknél és serdülőknél.

Módszerek In vitro vizsgálatok Az IL-1β perifériás vér mononukleáris sejtekben (PBMC) a génexpresszióra gyakorolt ​​hatásának meghatározására 7 egészséges felnőtt önkéntestől vettünk vérmintákat IRB által jóváhagyott protokoll szerint.

Elszigetelő szérum. A vért EDTA-csövekbe (BD, Franklin Lakes, NJ) gyűjtöttük, és 2500 fordulat/perc sebességgel centrifugáltuk 15 percig. A plazmaréteget topikális trombinnal (5000 U/ml, King Pharmaceuticals, Bristol, TN) kezeltük, amely össztérfogat 5%-a volt, és 38 °C-on 20 percig inkubáltuk. A keletkező vérrögöt eltávolítottuk a szérumból és eldobtuk.

Sejttenyésztés. PBMC-ket izoláltunk a sejtfrakcióból Lymphocyte Separation Medium (Mediatech, Manassas, VA) alkalmazásával végzett centrifugálással, majd PBS-sel (Mediatech, Manassas, VA) mostuk. A sejteket lyukanként 3 x 106 mennyiségben szélesztettük 6 lyukú lemezekre RPMI 1640-ben (Mediatech), amelyet 10% magzati szarvasmarha-szérummal (Atlanta Biologicals, Lawrenceville, GA), 10% autológ humán szérummal, 5,5 mM glükózzal, 100 U penicillinnel, 1000 egységekkel egészítettünk ki. µg/ml sztreptomicin, 50 µmol/l 2-merkaptoetanol és 5% HEPES. IL-1β-t (15 ng/ml végső koncentráció, Abcam, Cambridge, MA) vagy 9,3 µg/ml S100b-t (Sigma, St. Louis, MO) adtunk néhány mérőhelyhez. Minden kísérleti körülményt három párhuzamosban szélesztettünk. A sejteket 24 órás, 37 °C-on, 5% CO2 atmoszférában végzett inkubálás után gyűjtöttük össze.

Validálás RT-PCR-rel. A teljes RNS-t RNA-Stat 60 (Tel-Test, Friendswood, TX) alkalmazásával izoláltuk. A nagy kapacitású cDNS reverz transzkripciós készletet (Applied Biosystems, Carlsbad, CA) alkalmaztuk 750 ng RNS-sel a cDNS létrehozásához. A valós idejű PCR-t Roche LightCycler 480 rendszeren végeztük 5 ul cDNS-minta, a Roche LightCycler Probes Master kit és humán IL1B primerek (Applied Biosystems) felhasználásával. Az RNS mennyiségét delta Ct értékekkel határoztuk meg, belső kontrollként GADPH-t használva (Applied Biosystems).

Microarray elemzés. Minden kísérleti körülményhez három párhuzamos mintát egyesítettünk további elemzés céljából. 2-5 ug teljes RNS-ből a T7-dT(24) promoter szekvenciát tartalmazó kettős szálú cDNS-t GeneChip® One-Cycle cDNS Synthesis Kits (Invitrogen, Santa Clara, CA) segítségével állítottuk elő. A cRNS szintézise 200 ng cDNS-t használt in vitro transzkripcióhoz, amplifikációhoz és jelölési lépésekhez a gyártó utasításai szerint, az Illumina RNS amplifikációs készlettel (Ambion Inc, Austin, TX). 1,5 µg amplifikált biotinnal jelölt cRNS-t ezt követően hibridizáltunk Illumina Human HT-12 v3.0 Beadchip microarray-ekkel a standard protokollok szerint. a Baylor Immunológiai Kutatóintézetben, Dallas, TX.

A diákat Illumina Beadstation 500 készüléken szkennelték be, és az adatokat Beadstudio szoftverrel dolgozták fel. Minden egyes chip esetében a nyers intenzitásadatokat az adott chipen végzett összes mérés átlagos intenzitására normalizáltuk. Az adatokat a Genespring GX11 (Agilent) készülékbe importáltuk további elemzés céljából. A szondakészleteket akkor választottuk ki, ha bármely csoportban a minták legalább 50%-ában "jelen" vagy "marginális". A kiugró értékek kimutatására főkomponens-analízist végeztünk. Az osztály-összehasonlításokat t-próbákkal végeztük a log transzformáció után, az 1-es típusú hibaarányt a Benjamini-Hochberg hamis felfedezési arányok (FDR) segítségével szabályoztuk.

In vivo vizsgálatok Alanyok. A tanulmányt a Texasi Egyetem Southwestern Medical Center Institutional Review Board jóváhagyta. A szülőktől vagy törvényes gyámoktól írásos beleegyezést szereztek, a részvételhez pedig a 10 éves vagy annál idősebb alanyok hozzájárulását. A Dallas Gyermekgyógyászati ​​Központ 6 és 18 év közötti, 1-es típusú cukorbetegei a diagnózis felállításától számított egy héten belül jogosultak voltak. A kizárási kritériumok közé tartozott a szisztémás vagy inhalációs kortikoszteroidokkal vagy bármely más immunmoduláló gyógyszerrel végzett kezelés, aktív fertőzés, mycobacterialis betegség anamnézisében, terhesség vagy szoptatás, élő vakcina alkalmazása a vizsgálatba való beiratkozást követő 90 napon belül, valamint súlyos társbetegségek (például krónikus vesebetegség, szívbetegség). sikertelenség vagy nem kontrollált magas vérnyomás). A betegeket kizárták, ha nem volt egyértelmű, hogy 1-es vagy 2-es típusú cukorbetegségben szenvednek.

Az orvosi táblázatokból gyűjtött adatok a következőket tartalmazták: életkor, nem, rassz/etnikai hovatartozás, testsúly, magasság, hemoglobin A1c (HbA1c) és béta-hidroxi-butirát a diagnóziskor. A vizsgálatba való belépéskor vérmintát vettek; egy részét szűrőlaboratóriumokhoz elemezték, beleértve az alanin-aminotranszferázt (ALT), az aszpartát-aminotranszferázt (AST), a vér karbamid-nitrogénjét (BUN), a kreatinint, a teljes vérképet (CBC) differenciálművel, valamint a szérum terhességi tesztet minden menstruáló nőnél és minden olyan nőnél, aki túl van. életkor 10 év. Ezenkívül 20 ml-t dolgoztunk fel microarray analízishez.

A cukorbetegség kezelése A diagnózis felállításakor minden alany alap-bolus inzulin-kezelésben részesült glarginnal és lisproval vagy aszparttal. A vizsgálat időtartama alatt az inzulin dózisokat a standard klinikai protokoll szerint állítottuk be, a cél glükóz 80-140 mg/dl éhgyomorra és 80-180 mg/dl étkezés előtt. Minden vizsgálati látogatás alkalmával feljegyeztük az alany aktuális inzulindózisát és súlyát, hogy lehetővé tegyük a teljes napi dózis kiszámítását (egység/kg/nap).

Anakinra A vizsgálatba való felvétel után minden alany elkezdte az anakinrát (Kineret; Amgen, Thousand Oaks, CA) napi szubkután injekció formájában. A beiratkozáskor 25 kg-nál nagyobb testtömegű alanyok napi 100 mg-ot, míg a 25 kg-nál kisebb súlyúak napi 50 mg-ot kaptak. Az Anakinra-kezelést összesen 28 napig folytatták dózismódosítás nélkül.

Diabetes autoantitestek A standard protokoll szerint minden beteget teszteltek az inzulin, a protein tirozin-foszfatáz N típusú receptor (insulinoma-asszociált antigén (IA-2)) és a glutaminsav-dekarboxiláz (ARUP Laboratories, Salt Lake City, UT) elleni antitestekre. Ezeknek a vizsgálatoknak az eredményei jellemzően nem álltak rendelkezésre a vizsgálatba való beiratkozáskor, ezért nem használták őket a vizsgálatba való belépés kritériumaként. Mindazonáltal kizártuk a további elemzésből azokat a betegeket, akiknél mindhárom antitestre negatív eredmény született.

Felügyeleti laboratóriumi vizsgálatok Az anakinra-terápia befejezése után (a diagnózis után 4-5 héttel) vérmintát vettünk, és elküldtük az ALT-, AST-, BUN-, kreatinin- és CBC-vizsgálatokat differenciáltan. A szabványos protokoll szerint minden alanynál a gondozási helyen végzett hemoglobin A1c-t (DCA Vantage Analyzer, Siemens Healthcare Diagnostics, Deerfield, IL) és a kapilláris glükózt vizsgálták a klinikai látogatások alkalmával 4-5 héttel a diagnózis után, 4 hónappal a diagnózis után és 7 hónappal. diagnózis.

A nemkívánatos események monitorozása Az anakinra-terápia 28 napja alatt a vizsgálati személyek hetente felhívták az alanyokat, hogy dokumentálják a hipoglikémia gyakoriságát és a bőrkiütések jelenlétét, az injekció beadásának helyén fellépő reakciókat (duzzanat, bőrpír és fájdalom az anakinra beadása helyén), fejfájást, lázat és egyéb egyéb nemkívánatos események. Az anakinra-terápia befejezése után a betegeket minden további vizsgálati látogatás alkalmával értékelték a nemkívánatos események szempontjából.

Vegyes étkezési tolerancia tesztek (MMTT) Az MMTT-ket a Texasi Egyetem Southwestern Medical Center Klinikai Translációs Kutatóközpontjában (CTRC) végezték. Az alanyok MMTT-n estek át lényegében a leírtak szerint (8) a diagnózis után 3-4 héttel, majd 7 hónappal a diagnózis után. A C-peptid elemzéseket Dr. Philip Raskin (UT Southwestern Medical Center, Dallas, TX) laboratóriumában végeztük.

Microarray vérminta feldolgozás A Microarray vérmintákat EDTA csövekbe (BD Vacutainer) gyűjtöttük a vizsgálatba való beiratkozáskor, a diagnózis után 3-4 héttel és az anakinra terápia befejezése után. A PBMC-ket izoláltuk és -80 °C-on tároltuk a vérvételt követő 4 órán belül. A sejteket β-merkaptoetanolt (Qiagen, Valencia, CA) tartalmazó RLT lízispufferben lizáltuk. A teljes RNS-t az RNeasy® Mini Kit segítségével extraháltuk a gyártó által javasolt protokoll szerint (Qiagen, Valencia, CA), és a fent leírtak szerint elemeztük.

Kontroll csoportok Mivel az anakinra vizsgálat alanyait nem randomizálták, két különböző, már létező kontrollcsoportot használtunk. Az A kontrollcsoportba tartozó alanyokat korábban külön, IRB által jóváhagyott protokoll alapján vették fel intézményünkbe egy randomizált, kontrollált vizsgálatban, amely a hosszabb hatástartamú inzulin kezdeti megválasztásának a béta-sejtek funkcióvesztési ütemére gyakorolt ​​hatását vizsgálta. Az alanyokat a diabétesz diagnosztizálására kórházi kezelésük során vették fel, és randomizálták, hogy NPH-t vagy bazális inzulint (glargint vagy detemirt) kapjanak. A cukorbetegség ellátása és a rutin klinikai látogatások, a vegyes étkezési tolerancia tesztelésének ütemezése és eljárásai és a microarray analízis ugyanazok voltak, mint az anakinrával kezelt alanyainknál. Az A kontrollcsoportba az összes olyan beteg beletartozik, akit ebben a vizsgálatban bázisinzulinra randomizáltak, kivéve a negatív autoantitesttel rendelkezőket. eredmények.

A B kontrollcsoportba tartozó alanyokat a 2008 áprilisától 2009 novemberéig tartó összes új diabétesz-diagnózis diagramon azonosították, 9-18 éves korú betegeknél (a felvétel dátumtartományának és az anakinrával kezelt alanyok életkorának megfelelően). Ebbe a kontrollcsoportba azokat az alanyokat vontuk be, akik legalább egy pozitív autoantitesttel rendelkeztek, és nem vonták be őket az anakinra vizsgálatba. A diagnóziskor összegyűjtöttük az életkort, a nemet, a rassz/etnikai hovatartozást, a súlyt, a magasságot és a béta-hidroxi-butirátot. Gyűjtöttük a HbA1c-értéket és a teljes napi inzulin adagot (egység/kg/nap-ban kifejezve) a diagnózis felállításakor, valamint a diagnózis felállítását követő 1, 4 és 7 hónapos klinikai látogatások alkalmával.

Ezen alanyok közül 10 főből álló alcsoport beleegyezett abba, hogy beiratkozzon egy IRB által jóváhagyott vizsgálatba, amelyben vért vettek microarray elemzéshez a diagnózis felállításakor, majd 1 hónappal a diagnózis után. A Microarray eljárások megegyeztek az anakinrával kezelt alanyoknál leírtakkal.

Statisztikai elemzés Leíró statisztikákat állítottunk össze, és minden összehasonlító elemzést a SAS 9.2-es verziójával (Cary, NC) végeztünk. A C-peptid görbe alatti területét (AUC) minden MMTT-re kiszámítottuk trapéz módszerrel. Az inzulindózishoz igazított A1c-t (IDAA1c) a Mortensen et. al. (9), IDAA1c = hemoglobin A1C (százalék) + [4 × inzulinadag (egységek kilogrammonként 24 óránként)]. A csoportok közötti hemoglobin A1c és IDAA1c összehasonlítását Wilcoxon rang-összeg tesztekkel végeztük. Mivel a teljes napi inzulindózis normálisan oszlott el, a csoportok közötti összehasonlítást standard t-próbával végeztük.