Antiinflammatorisk terapi med Anakinra vid nydiagnostiserad typ 1-diabetes

Typ 1-diabetes mellitus (T1D) orsakas av autoimmun och autoinflammatorisk förstörelse av de insulinproducerande betacellerna i bukspottkörtelns öar i Langerhans. Historiskt sett har behandlingen för detta tillstånd bestått av insulinersättningsterapi och kostmodifiering. Nyligen genomförda studier har visat de potentiella fördelarna med immunmodulerande terapi hos patienter med nyligen diagnostiserad T1D för att förhindra ytterligare immunförmedlad skada. Hittills har det funnits en brist på avslutad forskning med hjälp av medel som riktar sig mot proinflammatoriska cytokiner dysregulerade i T1D.

IL1B, genen som kodar för det proinflammatoriska cytokinet interleukin-1β (IL-1β) är signifikant överuttryckt i perifera mononukleära blodceller (PBMC) hos patienter med nyligen diagnostiserad T1D jämfört med friska kontroller. Det finns gott om prejudikat för att stödja involveringen av IL-1β i patogenesen av diabetes. Speciellt hämmar inkubation av mänskliga eller djuriska öar eller insulinomcellinjer med IL-1β insulinutsöndring och leder till apoptos av betaceller.

Dessutom förbättrar IL-1-receptorantagonistproteinet, anakinra, den glykemiska kontrollen och insulinsekretionsförmågan hos patienter med typ 2-diabetes. Inga data har dock publicerats angående effektiviteten av medel riktade mot IL-1β för att modifiera sjukdomsförloppet hos patienter med T1D. Anti-Interleukin-1 in Diabetes Action (AIDA) är en randomiserad, placebokontrollerad klinisk prövning av anakinra på 160 vuxna med nydiagnostiserad typ 1-diabetes. Detta försök rekryterar för närvarande försökspersoner. Granskning av clinicaltrials.gov visar två andra planerade försök med IL-1-medel i nyligen diagnostiserad T1D, en med canakinumab, en monoklonal antikropp riktad mot IL-1β, och en annan med rilonacept, en cytokinfälla riktad mot IL-1β. För att bedöma effektiviteten av dessa läkemedel i framtida studier och i klinisk praxis kommer det att vara värdefullt att identifiera biomarkörer som gör att vi kan övervaka deras terapeutiska effekter. Men så vitt vi vet har mönstret av förändringar i genuttryck inducerade av IL-1β i normala PBMC inte studerats systematiskt, vilket gör det svårt att identifiera kandidatbiomarkörer för valideringsstudier.

I denna explorativa studie syftade vi till att bestämma vilka av de karakteristiska förändringarna i genuttryck från patienter med nyligen diagnostiserad T1D som är IL-1β-medierade, med användning av både in vitro och in vivo tillvägagångssätt. Vi bestämde också effektstorleken av en kort kurs av anakinra-terapi på glykemisk kontroll, insulindosering och C-peptidområde under kurvan under toleranstestning för blandad måltid (MMTT). Slutligen utvärderade vi tolerabiliteten av anakinra hos barn och ungdomar med nyligen diagnostiserad T1D.

Metoder In vitro-studier För att bestämma effekterna av IL-1β på genuttryck i perifera mononukleära blodceller (PBMC), samlades blodprover från 7 friska vuxna frivilliga enligt ett IRB-godkänt protokoll.

Isolerande serum. Blod uppsamlades i EDTA-rör (BD, Franklin Lakes, NJ) och centrifugerades vid 2500 rpm under 15 minuter. Plasmaskiktet behandlades med topikalt trombin (5000 U/ml, King Pharmaceuticals, Bristol, TN) motsvarande 5 % total volym och inkuberades vid 38° under 20 minuter. Den resulterande koageln avlägsnades från serumet och kasserades.

Cell kultur. PBMC isolerades från den cellulära fraktionen genom centrifugering med användning av Lymfocytseparationsmedium (Mediatech, Manassas, VA) och tvättades med PBS (Mediatech, Manassas, VA). Celler ströks ut med 3 x 106 per brunn i plattor med 6 brunnar i RPMI 1640 (Mediatech) kompletterat med 10% fetalt bovint serum (Atlanta Biologicals, Lawrenceville, GA), 10% autologt humant serum, 5,5 mM glukos, 100 U penicillin, 100 U penicillin µg/ml streptomycin, 50 µmol/l 2-merkaptoetanol och 5 % HEPES. IL-lp (15 ng/ml slutlig koncentration, Abcam, Cambridge, MA), eller 9,3 µg/ml S100b (Sigma, St. Louis, MO) sattes till några brunnar. Alla experimentella betingelser ströks ut i tre exemplar. Celler uppsamlades efter 24 timmars inkubation vid 37°C i en 5% CO2-atmosfär.

Validering med RT-PCR. Totalt RNA isolerades med användning av RNA-Stat 60 (Tel-Test, Friendswood, TX). High Capacity cDNA Reverse Transcription Kit (Applied Biosystems, Carlsbad, CA) användes med 750 ng RNA för att skapa cDNA. Realtids-PCR utfördes på Roche LightCycler 480-systemet med användning av 5 ul av cDNA-provet, Roche LightCycler Probes Master-kit och humana IL1B-primrar (Applied Biosystems). RNA kvantifierades genom delta Ct-värden med användning av GADPH som intern kontroll (Applied Biosystems).

Mikroarrayanalys. Trippelprover för varje experimentellt tillstånd slogs samman för ytterligare analys. Från 2-5 µg totalt RNA genererades dubbelsträngat cDNA innehållande T7-dT(24)-promotorsekvensen med användning av GeneChip® One-Cycle cDNA Synthesis Kits (Invitrogen, Santa Clara, CA). Syntes av cRNA använde 200 ng cDNA för in vitro-transkriptions-, amplifierings- och märkningssteg enligt tillverkarens instruktioner med hjälp av Illumina RNA-amplifieringskit (Ambion Inc, Austin, TX). 1,5 µg amplifierat biotinmärkt cRNA hybridiserades därefter till Illumina Human HT-12 v3.0 Beadchip-mikroarrayer enligt standardprotokoll. vid Baylor Institute for Immunology Research, Dallas, TX.

Slides skannades på en Illumina Beadstation 500 och data bearbetades med programvaran Beadstudio. För varje chip normaliserades råintensitetsdata till medelintensiteten för alla mätningar på det chipet. Data importerades till Genespring GX11 (Agilent) för vidare analys. Sonduppsättningar valdes om "Present" eller "Marginal" i minst 50 % av proverna i någon grupp. Principal komponentanalys utfördes för att upptäcka extremvärden. Klassjämförelser utfördes med hjälp av t-tester efter loggtransformation med typ 1-felfrekvensen kontrollerad med Benjamini-Hochbergs falska upptäcktsfrekvenser (FDR).

In vivo-studier Ämnen. Studien godkändes av Institutional Review Board vid University of Texas Southwestern Medical Center. Skriftligt informerat samtycke erhölls från föräldrar eller vårdnadshavare, och samtycke för deltagande erhölls från försökspersoner i åldern 10 år och äldre. Patienter vid Children's Medical Center Dallas mellan 6 och 18 år med typ 1-diabetes inom en vecka efter diagnos var berättigade. Uteslutningskriterier inkluderade behandling med systemiska eller inhalerade kortikosteroider eller något annat immunmodulerande läkemedel, aktiv infektion, historia av mykobakteriell sjukdom, graviditet eller amning, användning av ett levande vaccin inom 90 dagar efter inskrivningen av studien och allvarliga komorbiditeter (såsom kronisk njursjukdom, hjärta misslyckande eller okontrollerad hypertoni). Patienter exkluderades om det var oklart om de hade typ 1- eller typ 2-diabetes.

Data som samlats in från de medicinska diagrammen inkluderade ålder, kön, ras/etnicitet, vikt, längd, hemoglobin A1c (HbA1c) och beta-hydroxibutyrat vid diagnos. Ett blodprov togs vid studiestart; en del analyserades för screeninglabb inklusive alaninaminotransferas (ALT), aspartataminotransferas (AST), ureakväve i blodet (BUN), kreatinin, fullständigt blodvärde (CBC) med differential och serumgraviditetstest för alla menstruerande kvinnor och alla kvinnor över ålder 10 år. Dessutom bearbetades 20 ml för mikroarrayanalys.

Diabetesvård Vid diagnos sattes alla försökspersoner på en basalbolusinsulinregim med glargin och antingen lispro eller aspart. Under studiens varaktighet justerades insulindoserna enligt klinikens standardprotokoll med målglukos på 80-140 mg/dL fasta och 80-180 mg/dL före måltid. Vid varje studiebesök registrerade vi försökspersonens aktuella insulindoser och vikt för att möjliggöra beräkning av den totala dygnsdosen (enheter/kg/dag).

Anakinra Efter studieregistreringen påbörjade alla försökspersoner anakinra (Kineret; Amgen, Thousand Oaks, CA) som en subkutan daglig injektion. Försökspersoner som vägde mer än 25 kg vid tidpunkten för inskrivningen fick 100 mg dagligen medan de som vägde 25 kg eller mindre fick 50 mg dagligen. Anakinra fortsattes i totalt 28 dagar utan dosjustering.

Diabetesautoantikroppar Enligt standardprotokoll testades alla patienter för antikroppar mot insulin, proteintyrosinfosfatasreceptor typ N (insulinomassocierat antigen (IA-2)) och glutaminsyradekarboxylas (ARUP Laboratories, Salt Lake City, UT). Resultaten av dessa studier var vanligtvis inte tillgängliga vid tidpunkten för studieregistreringen och användes därför inte som kriterier för studiestart. Men vi uteslöt patienter med negativa resultat för alla tre antikroppar från ytterligare analys.

Övervakningslaboratorietester Efter avslutad anakinrabehandling (4-5 veckor efter diagnos) togs ett blodprov in och skickades för ALT, AST, BUN, kreatinin och CBC med differential. Enligt standardprotokoll hade alla försökspersoner hemoglobin A1c (DCA Vantage Analyzer, Siemens Healthcare Diagnostics, Deerfield, IL) och kapillärglukos testade vid klinikbesök 4-5 veckor efter diagnos, 4 månader efter diagnos och 7 månader efter diagnos.

Övervakning av biverkningar Under de 28 dagarna av anakinra-behandling ringde studiepersonal försökspersoner varje vecka för att dokumentera frekvensen av hypoglykemi och förekomst av hudutslag, reaktioner på injektionsstället (svullnad, erytem och smärta vid administreringsstället för anakinra), huvudvärk, feber och ev. andra negativa händelser. Efter avslutad anakinra-terapi utvärderades patienterna för biverkningar vid varje efterföljande studiebesök.

Mixed meal tolerance tests (MMTTs) MMTTs genomfördes vid University of Texas Southwestern Medical Center Clinical Translational Research Center (CTRC). Försökspersonerna genomgick MMTTs i huvudsak enligt beskrivningen (8) 3-4 veckor efter diagnosen och igen 7 månader efter diagnosen. C-peptidanalyser utfördes i laboratoriet hos Dr Philip Raskin (UT Southwestern Medical Center, Dallas, TX).

Microarray-blodprovsbearbetning Mikroarray-blodprover samlades in i EDTA-rör (BD Vacutainer) vid studieinskrivning, 3-4 veckor efter diagnos och efter avslutad anakinra-terapi. PBMC isolerades och lagrades vid -80°C inom 4 timmar efter blodprovtagningen. Celler lyserades i RLT-lysbuffert innehållande p-merkaptoetanol (Qiagen, Valencia, CA). Totalt RNA extraherades med användning av RNeasy® Mini Kit enligt tillverkarens rekommenderade protokoll (Qiagen, Valencia, CA) och analyserades enligt beskrivningen ovan.

Kontrollgrupper Eftersom försökspersoner i anakinra-studien inte randomiserades använde vi två olika redan existerande kontrollgrupper. Försökspersoner i kontrollgrupp A var tidigare inskrivna på vår institution under ett separat, IRB-godkänt protokoll i en randomiserad, kontrollerad studie som undersökte effekten av det initiala valet av längre verkande insulin på graden av förlust av betacellsfunktion. Försökspersonerna inkluderades under sin sjukhusvistelse för diabetesdiagnos och randomiserades till att få antingen NPH eller basalinsulin (glargin eller detemir). Diabetesvård och rutinmässiga klinikbesök, schema och procedurer för toleranstestning av blandad måltid och analys av mikroarray var desamma som för våra anakinra-behandlade försökspersoner. Kontrollgrupp A inkluderar alla patienter i den studien randomiserade att få basalinsulin, förutom de med negativ autoantikropp resultat.

Försökspersoner i kontrollgrupp B identifierades i en kartöversikt över alla nya diabetesdiagnoser från april 2008 till november 2009 hos patienter i åldern 9-18 år (för att matcha rekryteringsdatum och ålder för anakinra-behandlade patienter). Försökspersoner inkluderades i denna kontrollgrupp om de hade minst en positiv autoantikropp och inte var inskrivna i anakinra-studien. Vi samlade in ålder, kön, ras/etnicitet, vikt, längd och beta-hydroxibutyrat vid diagnos. Vi samlade också in HbA1c och total daglig insulindos (uttryckt som enheter/kg/dag) vid diagnos och för klinikbesök 1 månad, 4 månader och 7 månader efter diagnos.

En undergrupp av 10 av dessa försökspersoner samtyckte till att delta i en IRB-godkänd studie där blod togs för mikroarrayanalys vid diagnos och igen 1 månad efter diagnos. Mikroarrayprocedurer var desamma som beskrivits ovan för de anakinra-behandlade patienterna.

Statistisk analys Beskrivande statistik sammanställdes och alla jämförande analyser utfördes med SAS version 9.2 (Cary, NC). C-peptidarea under kurvan (AUC) beräknades för varje MMTT med användning av den trapetsformade metoden. Insulindosjusterad A1c (IDAA1c) beräknades enligt beskrivningen av Mortensen, et. al. (9), IDAA1c = hemoglobin A1C (procent) + [4 × insulindos (enheter per kilogram per 24 timmar)]. Hemoglobin A1c och IDAA1c mellan grupperna jämfördes med Wilcoxon rank-summetester. Eftersom den totala dagliga insulindosen var normalfördelad utfördes jämförelser mellan grupperna med standard t-test.