Ontstekingsremmende therapie met Anakinra bij nieuw gediagnosticeerde diabetes type 1

Diabetes mellitus type 1 (T1D) wordt veroorzaakt door auto-immuun- en auto-inflammatoire vernietiging van de insulineproducerende bètacellen in de pancreaseilandjes van Langerhans. Historisch gezien bestond de behandeling van deze aandoening uit insulinevervangingstherapie en aanpassing van het dieet. Recente studies hebben de potentiële voordelen aangetoond van immunomodulerende therapie bij patiënten met nieuw gediagnosticeerde T1D om verdere immuungemedieerde schade te voorkomen. Tot nu toe is er een gebrek aan voltooid onderzoek met middelen die zich richten op pro-inflammatoire cytokines die ontregeld zijn bij T1D.

IL1B, het gen dat codeert voor het pro-inflammatoire cytokine interleukine-1β (IL-1β), wordt significant tot overexpressie gebracht in perifere mononucleaire bloedcellen (PBMC) bij patiënten met nieuw gediagnosticeerde T1D in vergelijking met gezonde controles. Er is voldoende precedent om de betrokkenheid van IL-1β bij de pathogenese van diabetes te ondersteunen. In het bijzonder incubatie van menselijke of dierlijke eilandjes of insulinecellijnen met IL-1β remt de insulinesecretie en leidt tot apoptose van bètacellen.

Bovendien verbetert het IL-1-receptorantagonist-eiwit, anakinra, de glykemische controle en het insulinesecretoire vermogen bij patiënten met type 2-diabetes. Er zijn echter geen gegevens gepubliceerd over de werkzaamheid van middelen die gericht zijn op IL-1β bij het wijzigen van het verloop van de ziekte bij patiënten. met T1D. Anti-Interleukin-1 in Diabetes Action (AIDA) is een gerandomiseerde, placebogecontroleerde klinische studie van anakinra bij 160 volwassenen met nieuw gediagnosticeerde diabetes type 1. Deze proef rekruteert momenteel proefpersonen. Review van clinicaltrials.gov demonstreert twee andere geplande onderzoeken met IL-1-agentia bij nieuw gediagnosticeerde T1D, één met canakinumab, een monoklonaal antilichaam gericht tegen IL-1β, en een andere met rilonacept, een cytokineval gericht op IL-1β. Om de effectiviteit van deze geneesmiddelen in toekomstige studies en in de klinische praktijk te beoordelen, zal het waardevol zijn om biomarkers te identificeren waarmee we hun therapeutische effecten kunnen volgen. Voor zover wij weten, is het patroon van veranderingen in genexpressie geïnduceerd door IL-1β in normale PBMC echter niet systematisch bestudeerd, waardoor het moeilijk is om kandidaat-biomarkers voor validatiestudies te identificeren.

In deze verkennende studie wilden we bepalen welke van de karakteristieke veranderingen in genexpressie van patiënten met nieuw gediagnosticeerde T1D IL-1β-gemedieerd zijn, met behulp van zowel in vitro als in vivo benaderingen. We bepaalden ook de effectgrootte van een korte kuur met anakinra-therapie op glykemische controle, insulinedosering en C-peptide-gebied onder de curve tijdens mixed-meal tolerance testing (MMTT). Ten slotte evalueerden we de verdraagbaarheid van anakinra bij kinderen en adolescenten met nieuw gediagnosticeerde T1D.

Methoden In vitro studies Om de effecten van IL-1β op genexpressie in perifere mononucleaire bloedcellen (PBMC's) te bepalen, werden bloedmonsters verzameld van 7 gezonde volwassen vrijwilligers onder een IRB-goedgekeurd protocol.

Isolerend serum. Bloed werd verzameld in EDTA-buisjes (BD, Franklin Lakes, NJ) en 15 minuten gecentrifugeerd bij 2500 rpm. De plasmalaag werd behandeld met topicaal trombine (5000 U/ml, King Pharmaceuticals, Bristol, TN) gelijk aan 5% totaal volume en gedurende 20 minuten bij 38°C geïncubeerd. Het resulterende stolsel werd uit het serum verwijderd en weggegooid.

Cel cultuur. PBMC werden uit de cellulaire fractie geïsoleerd door centrifugatie met behulp van Lymphocyte Separation Medium (Mediatech, Manassas, VA) en gewassen met PBS (Mediatech, Manassas, VA). Cellen werden uitgeplaat met 3 x 106 per putje in platen met 6 putjes in RPMI 1640 (Mediatech) aangevuld met 10% foetaal runderserum (Atlanta Biologicals, Lawrenceville, GA), 10% autoloog menselijk serum, 5,5 mM glucose, 100 U penicilline, 100 µg/ml streptomycine, 50 µmol/l 2-mercapto-ethanol en 5% HEPES. IL-1β (15 ng/ml eindconcentratie, Abcam, Cambridge, MA), of 9,3 µg/ml S100b (Sigma, St. Louis, MO) werden aan enkele putjes toegevoegd. Alle experimentele omstandigheden werden in drievoud uitgeplaat. Cellen werden verzameld na 24 uur incubatie bij 37°C in een atmosfeer van 5% C02.

Validatie door RT-PCR. Totaal RNA werd geïsoleerd met behulp van RNA-Stat 60 (Tel-Test, Friendswood, TX). De cDNA Reverse Transcription Kit met hoge capaciteit (Applied Biosystems, Carlsbad, CA) werd gebruikt met 750 ng RNA om cDNA te maken. Real-time PCR werd uitgevoerd op het Roche LightCycler 480-systeem met behulp van 5 µl van het cDNA-monster, de Roche LightCycler Probes Master-kit en humane IL1B-primers (Applied Biosystems). RNA werd gekwantificeerd door delta Ct-waarden met behulp van GADPH als de interne controle (Applied Biosystems).

Microarray-analyse. Monsters in drievoud voor elke experimentele conditie werden samengevoegd voor verdere analyse. Van 2-5 µg totaal RNA werd dubbelstrengs cDNA dat de T7-dT(24)-promotersequentie bevat gegenereerd met behulp van GeneChip® One-Cycle cDNA Synthesis Kits (Invitrogen, Santa Clara, CA). Synthese van cRNA gebruikte 200 ng cDNA voor in vitro transcriptie-, amplificatie- en labelstappen volgens de instructies van de fabrikant met behulp van de Illumina RNA-amplificatiekit (Ambion Inc, Austin, TX). 1,5 µg geamplificeerd met biotine gemerkt cRNA werd vervolgens volgens standaardprotocollen gehybridiseerd met Illumina Human HT-12 v3.0 Beadchip-microarrays. aan het Baylor Institute for Immunology Research, Dallas, TX.

Dia's werden gescand op een Illumina Beadstation 500 en de gegevens werden verwerkt met Beadstudio-software. Voor elke chip werden de ruwe intensiteitsgegevens genormaliseerd naar de gemiddelde intensiteit van alle metingen op die chip. Gegevens werden geïmporteerd in Genespring GX11 (Agilent) voor verdere analyse. Sondesets werden geselecteerd als "Aanwezig" of "Marginaal" in ten minste 50% van de monsters in een groep. Er is een principale componentenanalyse uitgevoerd om uitschieters te detecteren. Klassevergelijkingen werden uitgevoerd met behulp van t-testen na logtransformatie met het Type 1-foutpercentage gecontroleerd met behulp van Benjamini-Hochberg valse ontdekkingspercentages (FDR).

In vivo studies Onderwerpen. De studie werd goedgekeurd door de Institutional Review Board van het Southwestern Medical Center van de Universiteit van Texas. Schriftelijke geïnformeerde toestemming werd verkregen van ouders of wettelijke voogden en toestemming voor deelname werd verkregen van proefpersonen van 10 jaar en ouder. Patiënten in het Children's Medical Center Dallas tussen de 6 en 18 jaar met diabetes type 1 binnen een week na de diagnose kwamen in aanmerking. Uitsluitingscriteria waren onder meer behandeling met systemische of inhalatiecorticosteroïden of een ander immunomodulerend geneesmiddel, actieve infectie, voorgeschiedenis van mycobacteriële ziekte, zwangerschap of borstvoeding, gebruik van een levend vaccin binnen 90 dagen na inschrijving in het onderzoek en ernstige comorbiditeit (zoals chronische nierziekte, hartfalen). falen of ongecontroleerde hypertensie). Patiënten werden uitgesloten als het onduidelijk was of ze diabetes type 1 of type 2 hadden.

Gegevens verzameld uit de medische dossiers omvatten leeftijd, geslacht, ras/etniciteit, gewicht, lengte, hemoglobine A1c (HbA1c) en bèta-hydroxybutyraat bij diagnose. Bij aanvang van het onderzoek werd een bloedmonster afgenomen; een deel werd geanalyseerd voor screeningslaboratoria, waaronder alanineaminotransferase (ALT), aspartaataminotransferase (AST), bloedureumstikstof (BUN), creatinine, compleet bloedbeeld (CBC) met differentiële en serumzwangerschapstest voor alle menstruerende vrouwen en alle vrouwen ouder dan leeftijd 10 jaar. Bovendien werd 20 ml verwerkt voor microarray-analyse.

Diabeteszorg Bij de diagnose kregen alle proefpersonen een basaal-bolusinsulineregime met glargine en lispro of aspart. Voor de duur van het onderzoek werden de insulinedoses aangepast volgens het standaard klinische protocol met een doelglucose van 80-140 mg/dl nuchter en 80-180 mg/dl vóór de maaltijd. Bij elk studiebezoek registreerden we de huidige insulinedoses en het gewicht van de proefpersoon om de totale dagelijkse dosis (eenheden/kg/dag) te kunnen berekenen.

Anakinra Na deelname aan de studie begonnen alle proefpersonen met anakinra (Kineret; Amgen, Thousand Oaks, CA) als een dagelijkse subcutane injectie. Proefpersonen die op het moment van inschrijving meer dan 25 kg wogen, kregen dagelijks 100 mg, terwijl proefpersonen die 25 kg of minder wogen 50 mg per dag kregen. Anakinra werd in totaal 28 dagen voortgezet zonder dosisaanpassing.

Auto-antilichamen tegen diabetes Volgens het standaardprotocol werden alle patiënten getest op antilichamen tegen insuline, proteïnetyrosinefosfatasereceptor type N (insulinoma-geassocieerd antigeen (IA-2)) en glutaminezuurdecarboxylase (ARUP Laboratories, Salt Lake City, UT). De resultaten van deze studies waren doorgaans niet beschikbaar op het moment van inschrijving voor de studie en werden daarom niet gebruikt als criteria voor deelname aan de studie. We hebben echter patiënten met negatieve resultaten voor alle drie de antilichamen uitgesloten van verdere analyse.

Surveillance laboratoriumtesten Na voltooiing van de anakinra-therapie (4-5 weken na de diagnose) werd een bloedmonster afgenomen en opgestuurd voor ALT, AST, BUN, creatinine en CBC met differentieel. Volgens het standaardprotocol werd bij alle proefpersonen hemoglobine A1c op het zorgpunt (DCA Vantage Analyzer, Siemens Healthcare Diagnostics, Deerfield, IL) en capillaire glucose getest bij bezoeken aan de kliniek 4-5 weken na de diagnose, 4 maanden na de diagnose en 7 maanden daarna. diagnose.

Monitoring van bijwerkingen Gedurende de 28 dagen van anakinra-therapie belde het onderzoekspersoneel de proefpersonen wekelijks op om de frequentie van hypoglykemie en de aanwezigheid van huiduitslag, reacties op de injectieplaats (zwelling, erytheem en pijn op de plaats van anakinra-toediening), hoofdpijn, koorts en eventuele andere ongewenste voorvallen. Na voltooiing van de anakinra-therapie werden de patiënten bij elk volgend studiebezoek beoordeeld op bijwerkingen.

Gemengde maaltijdtolerantietests (MMTT's) MMTT's werden uitgevoerd aan het University of Texas Southwestern Medical Center Clinical Translational Research Center (CTRC). De proefpersonen ondergingen MMTT's in wezen zoals beschreven (8) 3-4 weken na de diagnose en opnieuw 7 maanden na de diagnose. C-peptide-analyses werden uitgevoerd in het laboratorium van Dr. Philip Raskin (UT Southwestern Medical Center, Dallas, TX).

Verwerking van microarray-bloedmonsters Microarray-bloedmonsters werden verzameld in EDTA-buisjes (BD Vacutainer) bij inschrijving voor het onderzoek, 3-4 weken na de diagnose en na voltooiing van de anakinra-therapie. PBMC werden geïsoleerd en bewaard bij -80°C binnen 4 uur na de bloedafname. Cellen werden gelyseerd in RLT-lysisbuffer die P-mercapto-ethanol bevatte (Qiagen, Valencia, CA). Totaal RNA werd geëxtraheerd met behulp van de RNeasy® Mini Kit volgens het door de fabrikant aanbevolen protocol (Qiagen, Valencia, CA) en geanalyseerd zoals hierboven beschreven.

Controlegroepen Omdat proefpersonen in het anakinra-onderzoek niet gerandomiseerd waren, gebruikten we twee verschillende reeds bestaande controlegroepen. Onderwerpen in controlegroep A waren eerder ingeschreven bij onze instelling onder een apart, IRB-goedgekeurd protocol in een gerandomiseerde, gecontroleerde studie waarin het effect van de eerste keuze van langerwerkende insuline op de mate van verlies van bètacelfunctie werd onderzocht. Proefpersonen werden tijdens hun ziekenhuisopname ingeschreven voor diabetesdiagnose en gerandomiseerd om NPH of basale insuline (glargine of detemir) te krijgen. Diabeteszorg en routinekliniekbezoeken, het schema en de procedures voor het testen van gemengde maaltijden en microarray-analyse waren dezelfde als voor onze met anakinra behandelde proefpersonen. resultaten.

Proefpersonen in controlegroep B werden geïdentificeerd in een kaartoverzicht van alle nieuwe diabetesdiagnoses van april 2008 tot en met november 2009 bij patiënten van 9-18 jaar (om overeen te komen met het datumbereik van rekrutering en leeftijd van met anakinra behandelde proefpersonen). Proefpersonen werden in deze controlegroep opgenomen als ze ten minste één positief auto-antilichaam hadden en niet deelnamen aan het anakinra-onderzoek. We verzamelden leeftijd, geslacht, ras/etniciteit, gewicht, lengte en bèta-hydroxybutyraat bij de diagnose. We verzamelden ook HbA1c en de totale dagelijkse insulinedosis (uitgedrukt als eenheden/kg/dag) bij diagnose en voor kliniekbezoeken na 1 maand, 4 maanden en 7 maanden na de diagnose.

Een subgroep van 10 van deze proefpersonen stemde ermee in zich in te schrijven voor een IRB-goedgekeurde studie waarin bloed werd afgenomen voor microarray-analyse bij diagnose en opnieuw 1 maand na diagnose. Microarray-procedures waren dezelfde als hierboven beschreven voor de met anakinra behandelde proefpersonen.

Statistische analyse Er werden beschrijvende statistieken samengesteld en alle vergelijkende analyses werden uitgevoerd met behulp van SAS versie 9.2 (Cary, NC). C-peptide-gebied onder de curve (AUC) werd berekend voor elke MMTT met behulp van de trapeziummethode. Insuline-dosis aangepaste A1c (IDAA1c) werd berekend zoals uiteengezet door Mortensen, et. al. (9), IDAA1c = hemoglobine A1C (procent) + [4 × insulinedosis (eenheden per kilogram per 24 uur)]. Hemoglobine A1c en IDAA1c tussen groepen werden vergeleken met behulp van Wilcoxon rank-sum tests. Aangezien de totale dagelijkse insulinedosis normaal verdeeld was, werden vergelijkingen tussen de groepen uitgevoerd door middel van een standaard t-test.