Anti-inflammatorinen hoito Anakinran kanssa äskettäin diagnosoidussa tyypin 1 diabeteksessa

Tyypin 1 diabetes mellituksen (T1D) aiheuttaa insuliinia tuottavien beetasolujen autoimmuuninen ja autoinflammatorinen tuhoutuminen Langerhansin haiman saarekkeissa. Historiallisesti tämän sairauden hoito on koostunut insuliinikorvaushoidosta ja ruokavalion muuttamisesta. Viimeaikaiset tutkimukset ovat osoittaneet immunomodulatorisen hoidon mahdolliset hyödyt potilailla, joilla on äskettäin diagnosoitu T1D, jotta estetään lisää immuunivälitteisiä vaurioita. Toistaiseksi on ollut vähän valmiita tutkimuksia, joissa on käytetty aineita, jotka kohdistuvat tulehdusta edistäviin sytokiineihin, joiden säätely on häiriintynyt T1D:ssä.

IL1B, proinflammatorista sytokiinia interleukiini-1β (IL-1β) koodaava geeni, yli-ilmentää merkittävästi perifeerisen veren mononukleaarisoluissa (PBMC) potilailla, joilla on äskettäin diagnosoitu T1D verrattuna terveisiin kontrolleihin. On olemassa runsaasti ennakkotapauksia, jotka tukevat IL-1β:n osallistumista diabeteksen patogeneesiin. Erityisesti ihmisen tai eläimen saarekkeiden tai insulinoomasolulinjojen inkubointi IL-1p:n kanssa estää insuliinin erittymistä ja johtaa beetasolujen apoptoosiin.

Lisäksi IL-1-reseptorin antagonistiproteiini, anakinra, parantaa glukoositasapainoa ja insuliinin erityskykyä tyypin 2 diabetesta sairastavilla potilailla. Tietoja ei kuitenkaan ole julkaistu IL-1β:aan kohdistuvien aineiden tehokkuudesta sairauden kulun muokkaamisessa potilailla. T1D:n kanssa. Anti-Interleukin-1 in Diabetes Action (AIDA) on satunnaistettu, lumekontrolloitu kliininen anakinran tutkimus 160 aikuisella, joilla on äskettäin diagnosoitu tyypin 1 diabetes. Tähän kokeeseen rekrytoidaan parhaillaan koehenkilöitä. Katsaus Clinicaltrials.gov osoittaa kahta muuta suunniteltua koetta IL-1-aineista äskettäin diagnosoidussa T1D:ssä, joista toisessa käytettiin kanakinumabia, IL-1p:aan suunnattua monoklonaalista vasta-ainetta, ja toisessa rilonaseptia, IL-1p:aan kohdistuvaa sytokiiniloukkua. Näiden lääkkeiden tehokkuuden arvioimiseksi tulevissa tutkimuksissa ja kliinisessä käytännössä on arvokasta tunnistaa biomarkkerit, joiden avulla voimme seurata niiden terapeuttisia vaikutuksia. Parhaan tietomme mukaan IL-1β:n aiheuttamia muutoksia geeniekspressiossa normaalissa PBMC:ssä ei kuitenkaan ole tutkittu systemaattisesti, mikä vaikeuttaa ehdokkaiden biomarkkereiden tunnistamista validointitutkimuksia varten.

Tässä tutkivassa tutkimuksessa pyrimme määrittämään, mitkä äskettäin diagnosoitujen T1D-potilaiden geeniekspression tyypillisistä muutoksista ovat IL-1β-välitteisiä käyttämällä sekä in vitro että in vivo -lähestymistapoja. Määritimme myös lyhyen anakinra-hoidon vaikutuksen koon sokeritasapainoon, insuliiniannostukseen ja käyrän alla olevaan C-peptidialueeseen seka-ateriatoleranssitestauksen (MMTT) aikana. Lopuksi arvioimme anakinran siedettävyyden lapsilla ja nuorilla, joilla oli äskettäin diagnosoitu T1D.

Menetelmät In vitro -tutkimukset IL-1β:n vaikutusten määrittämiseksi geenin ilmentymiseen perifeerisen veren mononukleaarisissa soluissa (PBMC) kerättiin verinäytteitä 7 terveeltä aikuiselta vapaaehtoiselta IRB:n hyväksymän protokollan mukaisesti.

Eristävä seerumi. Veri kerättiin EDTA-putkiin (BD, Franklin Lakes, NJ) ja sentrifugoitiin nopeudella 2500 rpm 15 minuuttia. Plasmakerrosta käsiteltiin paikallisella trombiinilla (5 000 U/ml, King Pharmaceuticals, Bristol, TN), joka vastasi 5 % kokonaistilavuudesta, ja inkuboitiin 38 °C:ssa 20 minuuttia. Syntynyt hyytymä poistettiin seerumista ja heitettiin pois.

Soluviljely. PBMC eristettiin solufraktiosta sentrifugoimalla käyttämällä Lymphocyte Separation Mediumia (Mediatech, Manassas, VA) ja pestiin PBS:llä (Mediatech, Manassas, VA). Solut maljattiin tiheydellä 3 x 106 per kuoppa 6-kuoppaisille levyille RPMI 1640:ssä (Mediatech), johon oli lisätty 10 % naudan sikiön seerumia (Atlanta Biologicals, Lawrenceville, GA), 10 % autologista ihmisen seerumia, 5,5 mM glukoosia, 100 U penisilliiniä, 100 µg/ml streptomysiiniä, 50 µmol/l 2-merkaptoetanolia ja 5 % HEPES:ää. IL-1p (lopullinen konsentraatio 15 ng/ml, Abcam, Cambridge, MA) tai 9,3 ug/ml S100b (Sigma, St. Louis, MO) lisättiin joihinkin kuoppiin. Kaikki koeolosuhteet maljattiin kolmena rinnakkaisena. Solut kerättiin 24 tunnin inkuboinnin jälkeen 37 °C:ssa 5 % C02-atmosfäärissä.

Validointi RT-PCR:llä. Kokonais-RNA eristettiin käyttämällä RNA-Stat 60:tä (Tel-Test, Friendswood, TX). High Capacity cDNA Reverse Transcription Kit (Applied Biosystems, Carlsbad, CA) käytettiin 750 ng RNA:n kanssa cDNA:n luomiseen. Reaaliaikainen PCR suoritettiin Roche LightCycler 480 -järjestelmällä käyttämällä 5 ul:aa cDNA-näytettä, Roche LightCycler Probes Master -pakkausta ja ihmisen IL1B-alukkeita (Applied Biosystems). RNA kvantitoitiin delta Ct -arvoilla käyttämällä GADPH:ta sisäisenä kontrollina (Applied Biosystems).

Microarray-analyysi. Kolminkertaiset näytteet kustakin koeolosuhteista yhdistettiin lisäanalyysiä varten. 2-5 ug:sta kokonais-RNA:ta muodostettiin kaksijuosteinen cDNA, joka sisälsi T7-dT(24)-promoottorisekvenssin, käyttämällä GeneChip® One-Cycle cDNA Synthesis Kits -pakkauksia (Invitrogen, Santa Clara, CA). cRNA:n synteesissä käytettiin 200 ng cDNA:ta in vitro -transkriptio-, amplifikaatio- ja leimausvaiheisiin valmistajan ohjeiden mukaisesti käyttämällä Illumina RNA -amplifikaatiopakkausta (Ambion Inc, Austin, TX). 1,5 ug monistettua biotiinileimattua cRNA:ta hybridisoitiin tämän jälkeen Illumina Human HT-12 v3.0 Beadchip -mikrosiruihin standardikäytäntöjen mukaisesti. Baylor Institute for Immunology Researchissa, Dallasissa, TX.

Diat skannattiin Illumina Beadstation 500 -laitteella ja tiedot käsiteltiin Beadstudio-ohjelmistolla. Jokaisen sirun raaka-intensiteettitiedot normalisoitiin kaikkien kyseisellä sirulla tehtyjen mittausten keskimääräiseen intensiteettiin. Tiedot tuotiin Genespring GX11:een (Agilent) lisäanalyysiä varten. Koetinsarjat valittiin, jos "Nyllä" tai "Marginaali" vähintään 50 %:ssa näytteistä missä tahansa ryhmässä. Pääkomponenttianalyysi suoritettiin poikkeamien havaitsemiseksi. Luokkavertailut suoritettiin käyttämällä t-testejä log-muunnoksen jälkeen tyypin 1 virhesuhteella, jota kontrolloitiin käyttämällä Benjamini-Hochbergin vääriä havaitsemisprosentteja (FDR).

In vivo -tutkimukset Kohteet. Tutkimuksen hyväksyi Texasin yliopiston Southwestern Medical Centerin Institutional Review Board. Kirjallinen tietoinen suostumus saatiin vanhemmilta tai laillisilta huoltajilta, ja suostumus osallistumiseen saatiin 10-vuotiailta ja sitä vanhemmilta. Dallasin Children's Medical Centerin potilaat 6–18-vuotiaat, joilla oli tyypin 1 diabetes viikon sisällä diagnoosista, olivat kelvollisia. Poissulkemiskriteereitä olivat hoito systeemisillä tai inhaloitavilla kortikosteroideilla tai millä tahansa muulla immunomodulatorisella lääkkeellä, aktiivinen infektio, mykobakteerisairaus historiassa, raskaus tai imetys, elävän rokotteen käyttö 90 päivän kuluessa tutkimukseen ilmoittautumisesta ja vakavat rinnakkaissairaudet (kuten krooninen munuaissairaus, sydänsairaus). epäonnistuminen tai hallitsematon verenpaine). Potilaat suljettiin pois, jos oli epäselvää, oliko heillä tyypin 1 vai tyypin 2 diabetes.

Lääketieteellisistä kaavioista kerättyihin tietoihin sisältyi ikä, sukupuoli, rotu/etninen alkuperä, paino, pituus, hemoglobiini A1c (HbA1c) ja beetahydroksibutyraatti diagnoosin yhteydessä. Verinäyte otettiin tutkimukseen tullessa; osa analysoitiin seulontalaboratorioita varten, mukaan lukien alaniiniaminotransferaasi (ALT), aspartaattiaminotransferaasi (AST), veren ureatyppi (BUN), kreatiniini, täydellinen verenkuva (CBC) differentiaalisella ja seerumin raskaustestillä kaikille kuukautisilla ja kaikilta ylittäneiltä naisilta. ikä 10 vuotta. Lisäksi 20 ml käsiteltiin mikrosiruanalyysiä varten.

Diabeteshoito Diagnoosin yhteydessä kaikille koehenkilöille annettiin basaalibolusinsuliinihoito, jossa oli glarginia ja joko lisproa tai aspartia. Tutkimuksen keston ajan insuliiniannokset säädettiin kliinisen tavanomaisen protokollan mukaisesti siten, että tavoiteglukoosi oli 80-140 mg/dl paastossa ja 80-180 mg/dl ennen ateriaa. Jokaisella tutkimuskäynnillä kirjasimme koehenkilön nykyiset insuliiniannokset ja painon, jotta voidaan laskea kokonaisvuorokausiannos (yksikköä/kg/vrk).

Anakinra Tutkimukseen ilmoittautumisen jälkeen kaikki koehenkilöt aloittivat anakinran (Kineret; Amgen, Thousand Oaks, CA) ihonalaisena päivittäisenä injektiona. Tutkittavat, jotka painoivat yli 25 kg ilmoittautumishetkellä, saivat 100 mg päivässä, kun taas ne, jotka painoivat 25 kg tai vähemmän, saivat 50 mg päivässä. Anakinraa jatkettiin yhteensä 28 päivän ajan ilman annosta muutettua.

Diabetesautovasta-aineet Vakioprotokollan mukaisesti kaikki potilaat testattiin vasta-aineiden varalta insuliinille, proteiinityrosiinifosfataasireseptorille tyyppi N (insuliinioomaan liittyvä antigeeni (IA-2)) ja glutamiinihappodekarboksylaasi (ARUP Laboratories, Salt Lake City, UT). Näiden tutkimusten tulokset eivät tyypillisesti olleet saatavilla tutkimukseen ilmoittautumisen yhteydessä, eikä niitä sen vuoksi käytetty kriteereinä tutkimukseen osallistumiselle. Jätimme kuitenkin pois lisäanalyysistä potilaat, joilla oli negatiivinen tulos kaikista kolmesta vasta-aineesta.

Valvontalaboratoriokokeet Anakinra-hoidon päätyttyä (4-5 viikkoa diagnoosin jälkeen) otettiin verinäyte ja lähetettiin ALT-, AST-, BUN-, kreatiniini- ja CBC-arvot erotuskykyisesti. Vakioprotokollan mukaan kaikille koehenkilöille testattiin hoitopisteen hemoglobiini A1c (DCA Vantage Analyzer, Siemens Healthcare Diagnostics, Deerfield, IL) ja kapillaariglukoosi klinikalla 4–5 viikkoa diagnoosin jälkeen, 4 kuukautta diagnoosin jälkeen ja 7 kuukautta diagnoosin jälkeen. diagnoosi.

Haittavaikutusten seuranta 28 päivän anakinrahoidon aikana tutkimushenkilöstö soitti koehenkilöille viikoittain dokumentoidakseen hypoglykemian esiintymistiheyden ja ihottuman esiintymisen, pistoskohdan reaktiot (turvotus, punoitus ja kipu anakinra-antokohdassa), päänsärkyä, kuumetta ja muita muita haittatapahtumia. Anakinra-hoidon päätyttyä potilaista arvioitiin haittatapahtumat jokaisella seuraavalla tutkimuskäynnillä.

Seka-ateriatoleranssitestit (MMTT) MMTT:t suoritettiin Texasin yliopiston Southwestern Medical Centerin kliinisen translaation tutkimuskeskuksessa (CTRC). Koehenkilöille tehtiin MMTT:t olennaisesti kuvatulla tavalla (8) 3-4 viikkoa diagnoosin jälkeen ja uudelleen 7 kuukauden kuluttua diagnoosista. C-peptidianalyysit suoritettiin tohtori Philip Raskinin laboratoriossa (UT Southwestern Medical Center, Dallas, TX).

Microarray-verinäytteen käsittely Microarray-verinäytteet kerättiin EDTA-putkiin (BD Vacutainer) tutkimukseen ilmoittautumisen yhteydessä, 3-4 viikkoa diagnoosin jälkeen ja anakinrahoidon päätyttyä. PBMC eristettiin ja säilytettiin -80 °C:ssa 4 tunnin sisällä veren otosta. Solut hajotettiin RLT-lyysipuskurissa, joka sisälsi p-merkaptoetanolia (Qiagen, Valencia, CA). Kokonais-RNA uutettiin käyttämällä RNeasy® Mini Kit -sarjaa valmistajan suositteleman protokollan mukaisesti (Qiagen, Valencia, CA) ja analysoitiin edellä kuvatulla tavalla.

Kontrolliryhmät Koska anakinratutkimuksen koehenkilöitä ei satunnaistettu, käytimme kahta erilaista olemassa olevaa kontrolliryhmää. Kontrolliryhmän A koehenkilöt otettiin aiemmin mukaan laitokseemme erillisen, IRB-hyväksytyn protokollan mukaisesti satunnaistetussa, kontrolloidussa tutkimuksessa, jossa tutkittiin alkuperäisen pitkävaikutteisen insuliinin vaikutusta beetasolujen toiminnan menettämisen nopeuteen. Koehenkilöt otettiin mukaan sairaalahoidon aikana diabeteksen diagnoosia varten ja satunnaistettiin saamaan joko NPH-insuliinia tai perusinsuliinia (glargiinia tai detemiriä). Diabeteshoito ja rutiiniklinikallakäynnit, seka-ateriatoleranssitestien ja mikrosiruanalyysin aikataulu ja menettelyt olivat samat kuin anakinralla hoidetuilla koehenkilöillämme. Kontrolliryhmään A kuuluvat kaikki tutkimukseen osallistuneet potilaat, jotka on satunnaistettu saamaan perusinsuliinia, paitsi ne, joilla on negatiivinen autovasta-aine. tuloksia.

Vertailuryhmän B koehenkilöt tunnistettiin kaaviokatsauksessa kaikista uusista diabetesdiagnooseista huhtikuusta 2008 marraskuuhun 2009 9–18-vuotiailla potilailla (vastaamaan rekrytointiajankohtaa ja anakinralla hoidettujen koehenkilöiden ikää). Koehenkilöt sisällytettiin tähän kontrolliryhmään, jos heillä oli vähintään yksi positiivinen autovasta-aine eivätkä he olleet mukana anakinratutkimuksessa. Keräsimme diagnoosin yhteydessä iän, sukupuolen, rodun/etnisyyden, painon, pituuden ja beetahydroksibutyraatin. Keräsimme myös HbA1c:n ja päivittäisen insuliinin kokonaisannoksen (ilmaistuna yksikköinä/kg/vrk) diagnoosin yhteydessä ja klinikkakäynneillä 1 kuukauden, 4 kuukauden ja 7 kuukauden kuluttua diagnoosista.

Näistä 10 koehenkilön osaryhmä suostui ilmoittautumaan IRB-hyväksyttyyn tutkimukseen, jossa otettiin verta mikrosiruanalyysiä varten diagnoosin yhteydessä ja uudelleen 1 kuukausi diagnoosin jälkeen. Microarray-menettelyt olivat samat kuin edellä kuvattiin anakinralla hoidetuille henkilöille.

Tilastollinen analyysi Kuvaavat tilastot koottiin ja kaikki vertailevat analyysit suoritettiin käyttämällä SAS-versiota 9.2 (Cary, NC). C-peptidin käyrän alla oleva pinta-ala (AUC) laskettiin kullekin MMTT:lle käyttämällä puolisuunnikkaan muotoista menetelmää. Insuliiniannoksella säädetty A1c (IDAA1c) laskettiin Mortensenin et. al. (9), IDAA1c = hemoglobiini A1C (prosenttia) + [4 × insuliiniannos (yksikköä kilogrammaa kohti 24 tunnissa)]. Hemoglobiini A1c:tä ja IDAA1c:tä ryhmien välillä verrattiin käyttämällä Wilcoxonin rank-sum testejä. Koska päivittäinen insuliinin kokonaisannos jakautui normaalisti, ryhmien väliset vertailut suoritettiin tavallisella t-testillä.