Terapia antinfiammatoria con Anakinra nel diabete di tipo 1 di nuova diagnosi

Il diabete mellito di tipo 1 (T1D) è causato dalla distruzione autoimmune e autoinfiammatoria delle cellule beta produttrici di insulina nelle isole pancreatiche di Langerhans. Storicamente, il trattamento per questa condizione è consistito nella terapia sostitutiva dell'insulina e nella modifica della dieta. Studi recenti hanno dimostrato i potenziali benefici della terapia immunomodulatoria nei pazienti con T1D di nuova diagnosi per prevenire ulteriori danni immuno-mediati. Finora, c'è stata una scarsità di ricerche completate utilizzando agenti che prendono di mira le citochine pro-infiammatorie disregolate nel T1D.

IL1B, il gene che codifica per la citochina proinfiammatoria interleuchina-1β (IL-1β) è significativamente sovraespresso nelle cellule mononucleate del sangue periferico (PBMC) nei pazienti con T1D di nuova diagnosi rispetto ai controlli sani. C'è un ampio precedente a sostegno del coinvolgimento di IL-1β nella patogenesi del diabete. In particolare, l'incubazione di isole umane o animali o linee cellulari di insulinoma con IL-1β inibisce la secrezione di insulina e porta all'apoptosi delle cellule beta.

Inoltre, la proteina antagonista del recettore dell'IL-1, anakinra, migliora il controllo glicemico e la capacità secretoria dell'insulina nei pazienti con diabete di tipo 2. Tuttavia, non sono stati pubblicati dati sull'efficacia degli agenti mirati all'IL-1β nel modificare il decorso della malattia nei pazienti con T1D. Anti-Interleukin-1 in Diabetes Action (AIDA) è uno studio clinico randomizzato, controllato con placebo su anakinra in 160 adulti con diabete di tipo 1 di nuova diagnosi. Questo studio sta attualmente reclutando soggetti. Revisione di Clinicaltrials.gov dimostra altri due studi pianificati di agenti IL-1 nel T1D di nuova diagnosi, uno che utilizza canakinumab, un anticorpo monoclonale diretto contro IL-1β, e un altro che utilizza rilonacept, una trappola per citochine mirata a IL-1β. Per valutare l'efficacia di questi farmaci in studi futuri e nella pratica clinica, sarà utile identificare biomarcatori che ci consentano di monitorare i loro effetti terapeutici. Tuttavia, per quanto ne sappiamo, il pattern dei cambiamenti nell'espressione genica indotti dall'IL-1β nelle normali PBMC non è stato studiato sistematicamente, rendendo difficile l'identificazione di biomarcatori candidati per gli studi di validazione.

In questo studio esplorativo, abbiamo mirato a determinare quali dei cambiamenti caratteristici nell'espressione genica di pazienti con T1D di nuova diagnosi sono mediati da IL-1β, utilizzando approcci sia in vitro che in vivo. Abbiamo anche determinato la dimensione dell'effetto di un breve ciclo di terapia con anakinra sul controllo glicemico, sul dosaggio di insulina e sull'area del peptide C sotto la curva durante il test di tolleranza al pasto misto (MMTT). Infine, abbiamo valutato la tollerabilità di anakinra in bambini e adolescenti con T1D di nuova diagnosi.

Metodi Studi in vitro Per determinare gli effetti dell'IL-1β sull'espressione genica nelle cellule mononucleate del sangue periferico (PBMC), sono stati raccolti campioni di sangue da 7 volontari adulti sani secondo un protocollo approvato dall'IRB.

Siero isolante. Il sangue è stato raccolto in provette EDTA (BD, Franklin Lakes, NJ) e centrifugato a 2500 rpm per 15 minuti. Lo strato di plasma è stato trattato con trombina topica (5000 U/ml, King Pharmaceuticals, Bristol, TN) pari al 5% del volume totale e incubato a 38° per 20 minuti. Il coagulo risultante è stato rimosso dal siero e scartato.

Coltura cellulare. I PBMC sono stati isolati dalla frazione cellulare mediante centrifugazione utilizzando il Lymphocyte Separation Medium (Mediatech, Manassas, VA) e lavati con PBS (Mediatech, Manassas, VA). Le cellule sono state piastrate a 3 x 106 per pozzetto in piastre da 6 pozzetti in RPMI 1640 (Mediatech) integrate con siero bovino fetale al 10% (Atlanta Biologicals, Lawrenceville, GA), siero umano autologo al 10%, glucosio 5,5 mM, 100 U di penicillina, 100 µg/ml streptomicina, 50 µmol/l 2-mercaptoetanolo e 5% HEPES. IL-1β (concentrazione finale 15 ng/ml, Abcam, Cambridge, MA) o 9,3 µg/ml S100b (Sigma, St. Louis, MO) sono stati aggiunti ad alcuni pozzetti. Tutte le condizioni sperimentali sono state piastrate in triplicato. Le cellule sono state raccolte dopo 24 ore di incubazione a 37°C in atmosfera di CO2 al 5%.

Convalida mediante RT-PCR. L'RNA totale è stato isolato utilizzando RNA-Stat 60 (Tel-Test, Friendswood, TX). Il kit di trascrizione inversa del cDNA ad alta capacità (Applied Biosystems, Carlsbad, CA) è stato utilizzato con 750 ng di RNA per creare cDNA. La PCR in tempo reale è stata eseguita sul sistema Roche LightCycler 480 utilizzando 5 ul del campione di cDNA, il kit Roche LightCycler Probes Master e i primer IL1B umani (Applied Biosystems). L'RNA è stato quantificato dai valori delta Ct utilizzando GADPH come controllo interno (Applied Biosystems).

Analisi di microarray. Campioni triplicati per ciascuna condizione sperimentale sono stati raggruppati per ulteriori analisi. Da 2-5 µg di RNA totale, è stato generato cDNA a doppio filamento contenente la sequenza del promotore T7-dT(24) utilizzando i kit di sintesi del cDNA One-Cycle GeneChip® (Invitrogen, Santa Clara, CA). La sintesi di cRNA ha utilizzato 200 ng di cDNA per le fasi di trascrizione, amplificazione ed etichettatura in vitro secondo le istruzioni del produttore utilizzando il kit di amplificazione dell'RNA Illumina (Ambion Inc, Austin, TX). 1,5 μg di cRNA marcato con biotina amplificato è stato successivamente ibridato con microarray Illumina Human HT-12 v3.0 Beadchip secondo i protocolli standard. presso il Baylor Institute for Immunology Research, Dallas, TX.

I vetrini sono stati scansionati su una Illumina Beadstation 500 e i dati elaborati con il software Beadstudio. Per ogni chip, i dati grezzi di intensità sono stati normalizzati all'intensità media di tutte le misurazioni su quel chip. I dati sono stati importati in Genespring GX11 (Agilent) per ulteriori analisi. I set di sonde sono stati selezionati se "Presente" o "Marginale" in almeno il 50% dei campioni in qualsiasi gruppo. L'analisi dei componenti principali è stata eseguita per rilevare i valori anomali. I confronti di classe sono stati eseguiti utilizzando i test t dopo la trasformazione del log con il tasso di errore di tipo 1 controllato utilizzando i tassi di falsa scoperta (FDR) di Benjamini-Hochberg.

Studi in vivo Soggetti. Lo studio è stato approvato dall'Institutional Review Board del Southwestern Medical Center dell'Università del Texas. Il consenso informato scritto è stato ottenuto da genitori o tutori legali e il consenso alla partecipazione è stato ottenuto da soggetti di età pari o superiore a 10 anni. Erano ammissibili i pazienti del Children's Medical Center Dallas di età compresa tra 6 e 18 anni con diabete di tipo 1 entro una settimana dalla diagnosi. I criteri di esclusione includevano il trattamento con corticosteroidi sistemici o per via inalatoria o qualsiasi altro farmaco immunomodulatore, infezione attiva, anamnesi di malattia micobatterica, gravidanza o allattamento, uso di un vaccino vivo entro 90 giorni dall'arruolamento nello studio e comorbidità gravi (come malattia renale cronica, fallimento o ipertensione incontrollata). I pazienti sono stati esclusi se non era chiaro se avessero il diabete di tipo 1 o di tipo 2.

I dati raccolti dalle cartelle cliniche includevano età, sesso, razza/etnia, peso, altezza, emoglobina A1c (HbA1c) e beta-idrossibutirrato alla diagnosi. È stato prelevato un campione di sangue all'ingresso nello studio; una parte è stata analizzata per i laboratori di screening tra cui alanina aminotransferasi (ALT), aspartato aminotransferasi (AST), azoto ureico nel sangue (BUN), creatinina, emocromo completo (CBC) con differenziale e test di gravidanza su siero per tutte le donne mestruate e qualsiasi donna sopra età 10 anni. Inoltre, sono stati elaborati 20 mL per l'analisi di microarray.

Cura del diabete Alla diagnosi, tutti i soggetti sono stati sottoposti a un regime di insulina basal-bolus con glargine e lispro o aspart. Per tutta la durata dello studio, le dosi di insulina sono state aggiustate secondo il protocollo clinico standard con una glicemia target di 80-140 mg/dL a digiuno e 80-180 mg/dL prima dei pasti. Ad ogni visita dello studio, abbiamo registrato le attuali dosi di insulina e il peso del soggetto per consentire il calcolo della dose giornaliera totale (unità/kg/giorno).

Anakinra Dopo l'arruolamento nello studio, tutti i soggetti hanno iniziato anakinra (Kineret; Amgen, Thousand Oaks, CA) come iniezione sottocutanea giornaliera. I soggetti di peso superiore a 25 kg al momento dell'arruolamento hanno ricevuto 100 mg al giorno, mentre quelli di peso pari o inferiore a 25 kg hanno ricevuto 50 mg al giorno. Anakinra è stato continuato per un totale di 28 giorni senza alcun aggiustamento della dose.

Autoanticorpi del diabete Secondo il protocollo standard, tutti i pazienti sono stati testati per gli anticorpi contro l'insulina, il recettore della proteina tirosina fosfatasi di tipo N (antigene associato all'insulinoma (IA-2)) e la decarbossilasi dell'acido glutammico (ARUP Laboratories, Salt Lake City, UT). I risultati di questi studi in genere non erano disponibili al momento dell'arruolamento nello studio e pertanto non sono stati utilizzati come criteri per l'ingresso nello studio. Tuttavia, abbiamo escluso i pazienti con risultati negativi per tutti e tre gli anticorpi da ulteriori analisi.

Test di laboratorio di sorveglianza Al termine della terapia con anakinra (4-5 settimane dopo la diagnosi), è stato raccolto un campione di sangue e inviato per ALT, AST, azotemia, creatinina ed emocromo con differenziale. Secondo il protocollo standard, tutti i soggetti sono stati sottoposti a test dell'emoglobina A1c presso il punto di cura (DCA Vantage Analyzer, Siemens Healthcare Diagnostics, Deerfield, IL) e del glucosio capillare durante le visite cliniche 4-5 settimane dopo la diagnosi, 4 mesi dopo la diagnosi e 7 mesi dopo diagnosi.

Monitoraggio degli eventi avversi Durante i 28 giorni di terapia con anakinra, il personale dello studio ha chiamato settimanalmente i soggetti per documentare la frequenza di ipoglicemia e la presenza di rash, reazioni al sito di iniezione (gonfiore, eritema e dolore nel sito di somministrazione di anakinra), mal di testa, febbre e qualsiasi altri eventi avversi. Dopo il completamento della terapia con anakinra, i pazienti sono stati valutati per eventi avversi ad ogni successiva visita dello studio.

Test di tolleranza ai pasti misti (MMTT) Gli MMTT sono stati condotti presso il Centro di ricerca traslazionale clinica (CTRC) del Southwestern Medical Center dell'Università del Texas. I soggetti sono stati sottoposti a MMTT essenzialmente come descritto (8) a 3-4 settimane dopo la diagnosi e di nuovo a 7 mesi dopo la diagnosi. Le analisi del peptide C sono state eseguite nel laboratorio del Dr. Philip Raskin (UT Southwestern Medical Center, Dallas, TX).

Elaborazione del campione di sangue di microarray I campioni di sangue di microarray sono stati raccolti in provette EDTA (BD Vacutainer) all'arruolamento nello studio, 3-4 settimane dopo la diagnosi e al completamento della terapia con anakinra. Le PBMC sono state isolate e conservate a -80°C entro 4 ore dal prelievo di sangue. Le cellule sono state lisate in tampone di lisi RLT contenente β-mercaptoetanolo (Qiagen, Valencia, CA). L'RNA totale è stato estratto utilizzando il kit RNeasy® Mini secondo il protocollo raccomandato dal produttore (Qiagen, Valencia, CA) e analizzato come descritto sopra.

Gruppi di controllo Poiché i soggetti nello studio anakinra non sono stati randomizzati, abbiamo utilizzato due diversi gruppi di controllo preesistenti. I soggetti del gruppo di controllo A erano stati precedentemente arruolati presso il nostro istituto in base a un protocollo separato approvato dall'IRB in uno studio randomizzato e controllato che esaminava l'effetto della scelta iniziale dell'insulina ad azione prolungata sul tasso di perdita della funzione delle cellule beta. I soggetti sono stati arruolati durante il ricovero per la diagnosi del diabete e randomizzati a ricevere NPH o insulina basale (glargine o detemir). La cura del diabete e le visite cliniche di routine, il programma e le procedure per i test di tolleranza ai pasti misti e l'analisi dei microarray erano gli stessi dei nostri soggetti trattati con anakinra. Il gruppo di controllo A comprende tutti i pazienti in quello studio randomizzati a ricevere insulina basale, ad eccezione di quelli con autoanticorpi negativi risultati.

I soggetti del gruppo di controllo B sono stati identificati in una revisione della tabella di tutte le nuove diagnosi di diabete da aprile 2008 a novembre 2009 in pazienti di età compresa tra 9 e 18 anni (per corrispondere all'intervallo di date di reclutamento e all'età dei soggetti trattati con anakinra). I soggetti sono stati inclusi in questo gruppo di controllo se avevano almeno un autoanticorpo positivo e non erano stati arruolati nello studio anakinra. Abbiamo raccolto età, sesso, razza/etnia, peso, altezza e beta-idrossibutirrato alla diagnosi. Abbiamo anche raccolto l'HbA1c e la dose giornaliera totale di insulina (espressa in unità/kg/giorno) alla diagnosi e per le visite cliniche a 1 mese, 4 mesi e 7 mesi dopo la diagnosi.

Un sottogruppo di 10 di questi soggetti ha acconsentito ad arruolarsi in uno studio approvato dall'IRB in cui è stato prelevato sangue per l'analisi di microarray alla diagnosi e di nuovo 1 mese dopo la diagnosi. Le procedure di microarray erano le stesse descritte sopra per i soggetti trattati con anakinra.

Analisi statistica Sono state compilate statistiche descrittive e tutte le analisi comparative eseguite utilizzando SAS versione 9.2 (Cary, NC). L'area del peptide C sotto la curva (AUC) è stata calcolata per ciascun MMTT utilizzando il metodo trapezoidale. L'A1c aggiustato per la dose di insulina (IDAA1c) è stato calcolato come delineato da Mortensen, et. al. (9), IDAA1c = emoglobina A1C (percentuale) + [4 × dose di insulina (unità per chilogrammo per 24 ore)]. L'emoglobina A1c e IDAA1c tra i gruppi sono stati confrontati utilizzando i test di somma dei ranghi di Wilcoxon. Poiché la dose giornaliera totale di insulina era normalmente distribuita, i confronti tra i gruppi sono stati eseguiti mediante test t standard.