Противовоспалительная терапия анакинрой при недавно диагностированном диабете 1 типа

Сахарный диабет 1 типа (СД1) вызывается аутоиммунным и аутовоспалительным разрушением бета-клеток, продуцирующих инсулин, в островках Лангерганса поджелудочной железы. Исторически сложилось так, что лечение этого состояния состояло из заместительной инсулинотерапии и модификации диеты. Недавние исследования продемонстрировали потенциальные преимущества иммуномодулирующей терапии у пациентов с недавно диагностированным СД1 для предотвращения дальнейшего иммуноопосредованного повреждения. До сих пор было мало завершенных исследований с использованием агентов, нацеленных на провоспалительные цитокины, нарушенные при СД1.

IL1B, ген, кодирующий провоспалительный цитокин интерлейкин-1β (IL-1β), значительно избыточно экспрессируется в мононуклеарных клетках периферической крови (PBMC) у пациентов с недавно диагностированным СД1 по сравнению со здоровым контролем. Существует множество прецедентов, подтверждающих участие IL-1β в патогенезе диабета. В частности, инкубация островков человека или животных или клеточных линий инсулиномы с IL-1β ингибирует секрецию инсулина и приводит к апоптозу бета-клеток.

Кроме того, белок-антагонист рецептора IL-1, анакинра, улучшает гликемический контроль и способность к секреции инсулина у пациентов с диабетом 2 типа. с Т1Д. Anti-Interleukin-1 in Diabetes Action (AIDA) представляет собой рандомизированное плацебо-контролируемое клиническое исследование анакинры у 160 взрослых с недавно диагностированным диабетом 1 типа. Это испытание в настоящее время набирает испытуемых. Обзор клинических испытаний.gov демонстрирует два других запланированных испытания агентов ИЛ-1 при недавно диагностированном СД1, одно с использованием канакинумаба, моноклонального антитела, направленного против ИЛ-1β, и другое с использованием рилонацепта, цитокиновой ловушки, нацеленной на ИЛ-1β. Для оценки эффективности этих препаратов в будущих исследованиях и в клинической практике будет полезно определить биомаркеры, которые позволят нам контролировать их терапевтические эффекты. Однако, насколько нам известно, модель изменений экспрессии генов, индуцированных IL-1β в нормальных PBMC, систематически не изучалась, что затрудняет идентификацию биомаркеров-кандидатов для проверочных исследований.

В этом предварительном исследовании мы стремились определить, какие из характерных изменений в экспрессии генов у пациентов с недавно диагностированным СД1 опосредованы ИЛ-1β, используя подходы как in vitro, так и in vivo. Мы также определили размер эффекта короткого курса терапии анакинрой на гликемический контроль, дозировку инсулина и площадь C-пептида под кривой во время теста на переносимость смешанной пищи (MMTT). Наконец, мы оценили переносимость анакинры у детей и подростков с недавно диагностированным СД1.

Методы Исследования in vitro Для определения влияния IL-1β на экспрессию генов в мононуклеарных клетках периферической крови (PBMC) образцы крови были взяты у 7 здоровых взрослых добровольцев в соответствии с протоколом, одобренным IRB.

Изолирующая сыворотка. Кровь собирали в пробирки с ЭДТА (BD, Franklin Lakes, NJ) и центрифугировали при 2500 об/мин в течение 15 минут. Плазменный слой обрабатывали тромбином для местного применения (5000 ЕД/мл, King Pharmaceuticals, Bristol, TN) в количестве 5% от общего объема и инкубировали при 38° в течение 20 минут. Образовавшийся сгусток удаляли из сыворотки и выбрасывали.

Культура клеток. РВМС выделяли из клеточной фракции центрифугированием с использованием среды для разделения лимфоцитов (Mediatech, Manassas, VA) и промывали PBS (Mediatech, Manassas, VA). Клетки высевали по 3×106 на лунку в 6-луночные планшеты в RPMI 1640 (Mediatech) с добавлением 10% эмбриональной телячьей сыворотки (Atlanta Biologicals, Lawrenceville, GA), 10% аутологичной человеческой сыворотки, 5,5 мМ глюкозы, 100 ЕД пенициллина, 100 мкл. мкг/мл стрептомицина, 50 мкмоль/л 2-меркаптоэтанола и 5% HEPES. В некоторые лунки добавляли IL-1β (конечная концентрация 15 нг/мл, Abcam, Кембридж, Массачусетс) или 9,3 мкг/мл S100b (Sigma, Сент-Луис, Миссури). Все экспериментальные условия высевали в трех экземплярах. Клетки собирали через 24 часа инкубации при 37°С в атмосфере с 5% СО2.

Валидация с помощью ОТ-ПЦР. Тотальную РНК выделяли с использованием RNA-Stat 60 (Tel-Test, Friendswood, TX). Набор для обратной транскрипции кДНК высокой емкости (Applied Biosystems, Карлсбад, Калифорния) использовали с 750 нг РНК для создания кДНК. ПЦР в реальном времени проводили на системе Roche LightCycler 480 с использованием 5 мкл образца кДНК, набора Roche LightCycler Probes Master и праймеров человеческого IL1B (Applied Biosystems). РНК количественно определяли по значениям дельта Ct, используя GADPH в качестве внутреннего контроля (Applied Biosystems).

Микроматричный анализ. Тройные образцы для каждого экспериментального условия были объединены для дальнейшего анализа. Из 2-5 мкг общей РНК получали двухцепочечную кДНК, содержащую промоторную последовательность T7-dT(24), с использованием наборов для синтеза кДНК GeneChip® One-Cycle (Invitrogen, Санта-Клара, Калифорния). Для синтеза кРНК использовали 200 нг кДНК для стадий транскрипции, амплификации и мечения in vitro в соответствии с инструкциями производителя с использованием набора для амплификации РНК Illumina (Ambion Inc, Остин, Техас). Затем 1,5 мкг амплифицированной кРНК, меченной биотином, гибридизовали с микрочипами Illumina Human HT-12 v3.0 Beadchip в соответствии со стандартными протоколами. в Бейлорском институте иммунологических исследований, Даллас, Техас.

Слайды сканировали на Illumina Beadstation 500, а данные обрабатывали с помощью программного обеспечения Beadstudio. Для каждого чипа необработанные данные интенсивности были нормализованы к средней интенсивности всех измерений на этом чипе. Данные были импортированы в Genespring GX11 (Agilent) для дальнейшего анализа. Наборы зондов были выбраны, если «Присутствует» или «Маргинальный» по крайней мере в 50% образцов в любой группе. Для обнаружения выбросов был проведен анализ главных компонент. Сравнения классов проводились с использованием t-тестов после логарифмического преобразования с частотой ошибок типа 1, контролируемой с использованием коэффициентов ложных открытий Бенджамини-Хохберга (FDR).

Субъекты исследований in vivo. Исследование было одобрено Институциональным наблюдательным советом Юго-западного медицинского центра Техасского университета. Письменное информированное согласие было получено от родителей или законных опекунов, а согласие на участие было получено от субъектов в возрасте 10 лет и старше. Пациенты Детского медицинского центра Далласа в возрасте от 6 до 18 лет с диабетом 1 типа в течение одной недели после постановки диагноза имели право на участие. Критерии исключения включали лечение системными или ингаляционными кортикостероидами или любыми другими иммуномодулирующими препаратами, активную инфекцию, микобактериальные заболевания в анамнезе, беременность или лактацию, использование живой вакцины в течение 90 дней после включения в исследование и тяжелые сопутствующие заболевания (такие как хроническая болезнь почек, сердечно-сосудистые заболевания). недостаточность или неконтролируемая артериальная гипертензия). Пациентов исключали, если было неясно, страдали ли они сахарным диабетом 1 или 2 типа.

Данные, собранные из медицинских карт, включали возраст, пол, расу/этническую принадлежность, вес, рост, гемоглобин A1c (HbA1c) и бета-гидроксибутират на момент постановки диагноза. Образец крови был получен при включении в исследование; часть была проанализирована для скрининговых лабораторий, включая аланинаминотрансферазу (ALT), аспартатаминотрансферазу (AST), азот мочевины крови (BUN), креатинин, общий анализ крови (CBC) с дифференциальным и сывороточный тест на беременность для всех менструирующих женщин и любой женщины старше возраст 10 лет. Кроме того, 20 мл обрабатывали для микрочипового анализа.

Лечение диабета При постановке диагноза всем субъектам был назначен базально-болюсный режим инсулинотерапии с гларгином и либо лизпро, либо аспартом. На время исследования дозы инсулина корректировали в соответствии со стандартным клиническим протоколом с целевым уровнем глюкозы 80-140 мг/дл натощак и 80-180 мг/дл перед едой. При каждом посещении исследования мы записывали текущие дозы инсулина и вес субъекта, чтобы можно было рассчитать общую суточную дозу (ЕД/кг/день).

Анакинра После включения в исследование все субъекты начали принимать анакинру (Кинерет; Амджен, Таузенд-Оукс, Калифорния) в виде подкожной ежедневной инъекции. Субъекты с массой тела более 25 кг на момент регистрации получали 100 мг в день, тогда как лица с массой тела 25 кг и менее получали 50 мг в день. Анакинру продолжали принимать в общей сложности 28 дней без коррекции дозы.

Диабетические аутоантитела В соответствии со стандартным протоколом все пациенты были протестированы на наличие антител к инсулину, рецептору протеинтирозинфосфатазы типа N (инсулинома-ассоциированный антиген (IA-2)) и декарбоксилазе глутаминовой кислоты (ARUP Laboratories, Солт-Лейк-Сити, Юта). Результаты этих исследований, как правило, были недоступны на момент включения в исследование и поэтому не использовались в качестве критериев для включения в исследование. Однако мы исключили пациентов с отрицательными результатами для всех трех антител из дальнейшего анализа.

Контрольные лабораторные анализы По завершении терапии анакинрой (через 4–5 недель после постановки диагноза) брали образец крови и направляли на определение АЛТ, АСТ, мочевины мочевины, креатинина и общего анализа крови с дифференциальным диагнозом. В соответствии со стандартным протоколом всем субъектам проверяли гемоглобин A1c по месту оказания медицинской помощи (анализатор DCA Vantage, Siemens Healthcare Diagnostics, Дирфилд, Иллинойс) и измеряли капиллярную глюкозу во время визитов в клинику через 4-5 недель после постановки диагноза, через 4 месяца после постановки диагноза и через 7 месяцев после диагноз.

Мониторинг нежелательных явлений В течение 28 дней терапии анакинрой исследовательский персонал еженедельно звонил испытуемым, чтобы документировать частоту гипогликемии и наличие сыпи, реакции в месте инъекции (отек, эритема и боль в месте введения анакинры), головные боли, лихорадку и любые другие симптомы. другие нежелательные явления. После завершения терапии анакинрой у пациентов оценивали нежелательные явления при каждом последующем визите в рамках исследования.

Тесты на переносимость смешанной пищи (MMTT) MMTT были проведены в Центре клинических трансляционных исследований Юго-Западного медицинского центра Техасского университета (CTRC). Субъекты прошли MMTT по существу, как описано (8), через 3-4 недели после постановки диагноза и снова через 7 месяцев после постановки диагноза. Анализы С-пептида проводились в лаборатории доктора Филипа Раскина (Юго-Западный медицинский центр UT, Даллас, Техас).

Обработка образцов крови на микрочипах Образцы крови на микрочипах собирали в пробирки с ЭДТА (BD Vacutainer) при включении в исследование, через 3–4 недели после постановки диагноза и после завершения терапии анакинрой. РВМС выделяли и хранили при -80°С в течение 4 часов после забора крови. Клетки лизировали в лизирующем буфере RLT, содержащем β-меркаптоэтанол (Qiagen, Валенсия, Калифорния). Тотальную РНК экстрагировали с использованием набора RNeasy® Mini Kit в соответствии с протоколом, рекомендованным производителем (Qiagen, Валенсия, Калифорния), и анализировали, как описано выше.

Контрольные группы Поскольку участники исследования анакинры не были рандомизированы, мы использовали две разные ранее существовавшие контрольные группы. Субъекты из контрольной группы А ранее были зарегистрированы в нашем учреждении в соответствии с отдельным протоколом, одобренным IRB, в рандомизированном контролируемом исследовании, в котором изучалось влияние первоначального выбора инсулина более длительного действия на скорость потери функции бета-клеток. Субъекты были включены во время их госпитализации для диагностики диабета и рандомизированы для получения либо НПХ, либо базального инсулина (гларгин или детемир). Лечение диабета и рутинные визиты в клинику, график и процедуры для тестирования переносимости смешанной пищи и микрочипового анализа были такими же, как и для наших субъектов, получавших анакинру. Результаты.

Субъекты в контрольной группе B были идентифицированы в обзоре диаграммы всех новых диагнозов диабета с апреля 2008 г. по ноябрь 2009 г. у пациентов в возрасте 9-18 лет (чтобы соответствовать диапазону дат набора и возрасту субъектов, получавших анакинру). Субъекты включались в эту контрольную группу, если у них было хотя бы одно положительное аутоантитело и они не участвовали в исследовании анакинры. Мы собрали возраст, пол, расу/этническую принадлежность, вес, рост и бета-гидроксибутират при постановке диагноза. Мы также собирали HbA1c и общую суточную дозу инсулина (в единицах/кг/день) при постановке диагноза и при посещении клиники через 1 месяц, 4 месяца и 7 месяцев после постановки диагноза.

Подмножество из 10 из этих субъектов согласились участвовать в одобренном IRB исследовании, в котором кровь для микрочипового анализа брали при постановке диагноза и еще раз через 1 месяц после постановки диагноза. Процедуры микрочипа были такими же, как описано выше для субъектов, получавших анакинру.

Статистический анализ Были собраны описательные статистические данные, и все сравнительные анализы были выполнены с использованием SAS версии 9.2 (Cary, NC). Площадь C-пептида под кривой (AUC) рассчитывали для каждого MMTT с использованием метода трапеций. A1c с поправкой на дозу инсулина (IDAA1c) рассчитывали, как описано Mortensen, et. др. (9), IDAA1c = гемоглобин A1C (в процентах) + [4 × доза инсулина (единиц на килограмм в сутки)]. Гемоглобин A1c и IDAA1c между группами сравнивали с использованием критерия суммы рангов Уилкоксона. Поскольку общая суточная доза инсулина распределялась нормально, сравнения между группами проводили с помощью стандартного t-критерия.