Terapia anti-inflamatória com anakinra em diabetes tipo 1 recém-diagnosticado

O diabetes mellitus tipo 1 (T1D) é causado pela destruição autoimune e autoinflamatória das células beta produtoras de insulina nas ilhotas pancreáticas de Langerhans. Historicamente, o tratamento para essa condição consistia em terapia de reposição de insulina e modificação da dieta. Estudos recentes demonstraram os benefícios potenciais da terapia imunomoduladora em pacientes com DM1 recém-diagnosticado para prevenir mais danos mediados pelo sistema imunológico. Até agora, houve uma escassez de pesquisas concluídas usando agentes que visam citocinas pró-inflamatórias desreguladas no DM1.

IL1B, o gene que codifica a citocina pró-inflamatória interleucina-1β (IL-1β), é significativamente superexpresso em células mononucleares do sangue periférico (PBMC) em pacientes com DM1 recém-diagnosticado em comparação com controles saudáveis. Há um amplo precedente para apoiar o envolvimento de IL-1β na patogênese do diabetes. Em particular, a incubação de ilhotas humanas ou animais ou linhas celulares de insulinoma com IL-1β inibe a secreção de insulina e leva à apoptose das células beta.

Além disso, a proteína antagonista do receptor de IL-1, anakinra, melhora o controle glicêmico e a capacidade de secreção de insulina em pacientes com diabetes tipo 2. No entanto, não foram publicados dados sobre a eficácia de agentes direcionados a IL-1β na modificação do curso da doença em pacientes com T1D. O Anti-Interleucina-1 na Ação do Diabetes (AIDA) é um ensaio clínico randomizado, controlado por placebo, de anakinra em 160 adultos com diabetes tipo 1 recém-diagnosticado. Este estudo está atualmente recrutando indivíduos. Revisão de Clinicaltrials.gov demonstra dois outros ensaios planejados de agentes IL-1 em T1D recém-diagnosticado, um usando canaquinumabe, um anticorpo monoclonal direcionado a IL-1β, e outro usando rilonacept, uma armadilha de citocinas direcionada a IL-1β. Para avaliar a eficácia dessas drogas em estudos futuros e na prática clínica, será valioso identificar biomarcadores que permitam monitorar seus efeitos terapêuticos. No entanto, até onde sabemos, o padrão de alterações na expressão gênica induzida por IL-1β em PBMC normais não foi sistematicamente estudado, dificultando a identificação de biomarcadores candidatos para estudos de validação.

Neste estudo exploratório, objetivamos determinar quais das alterações características na expressão gênica de pacientes com DM1 recém-diagnosticado são mediadas por IL-1β, usando abordagens in vitro e in vivo. Também determinamos o tamanho do efeito de um curto período de terapia com anakinra no controle glicêmico, dosagem de insulina e área do peptídeo C sob a curva durante o teste de tolerância a refeições mistas (MMTT). Finalmente, avaliamos a tolerabilidade de anakinra em crianças e adolescentes com diagnóstico recente de DM1.

Métodos Estudos in vitro Para determinar os efeitos de IL-1β na expressão gênica em células mononucleares do sangue periférico (PBMC), amostras de sangue foram coletadas de 7 voluntários adultos saudáveis ​​sob um protocolo aprovado pelo IRB.

Soro isolante. O sangue foi coletado em tubos EDTA (BD, Franklin Lakes, NJ) e centrifugado a 2500 rpm por 15 minutos. A camada de plasma foi tratada com trombina tópica (5000 U/ml, King Pharmaceuticals, Bristol, TN) igualando 5% do volume total e incubada a 38° durante 20 minutos. O coágulo resultante foi removido do soro e descartado.

Cultura de células. As PBMC foram isoladas da fração celular por centrifugação usando meio de separação de linfócitos (Mediatech, Manassas, VA) e lavadas com PBS (Mediatech, Manassas, VA). As células foram plaqueadas a 3 x 106 por poço em placas de 6 poços em RPMI 1640 (Mediatech) suplementado com 10% de soro fetal bovino (Atlanta Biologicals, Lawrenceville, GA), 10% de soro humano autólogo, 5,5 mM de glicose, 100 U de penicilina, 100 µg/ml estreptomicina, 50 µmol/l 2-mercaptoetanol e 5% HEPES. IL-1β (concentração final de 15 ng/ml, Abcam, Cambridge, MA) ou 9,3 µg/ml S100b (Sigma, St. Louis, MO) foram adicionados a alguns poços. Todas as condições experimentais foram plaqueadas em triplicado. As células foram coletadas após 24 horas de incubação a 37°C em uma atmosfera de 5% de CO2.

Validação por RT-PCR. O RNA total foi isolado usando RNA-Stat 60 (Tel-Test, Friendswood, TX). O kit de transcrição reversa de cDNA de alta capacidade (Applied Biosystems, Carlsbad, CA) foi usado com 750 ng de RNA para criar cDNA. A PCR em tempo real foi realizada no sistema Roche LightCycler 480 usando 5 ul da amostra de cDNA, o kit Roche LightCycler Probes Master e primers IL1B humanos (Applied Biosystems). O RNA foi quantificado por valores delta Ct usando GADPH como controle interno (Applied Biosystems).

Análise de microarranjo. Amostras em triplicado para cada condição experimental foram reunidas para análise posterior. A partir de 2-5 µg de RNA total, cDNA de fita dupla contendo a sequência do promotor T7-dT(24) foi gerado usando GeneChip® One-Cycle cDNA Synthesis Kits (Invitrogen, Santa Clara, CA). A síntese de cRNA utilizou 200 ng de cDNA para etapas de transcrição, amplificação e marcação in vitro de acordo com as instruções do fabricante usando o kit de amplificação de RNA Illumina (Ambion Inc, Austin, TX). 1,5 µg de cRNA marcado com biotina amplificado foi subsequentemente hibridizado com microarrays de Beadchip Illumina Human HT-12 v3.0 de acordo com protocolos padrão. no Baylor Institute for Immunology Research, Dallas, TX.

As lâminas foram digitalizadas em um Illumina Beadstation 500 e os dados processados ​​com o software Beadstudio. Para cada chip, os dados brutos de intensidade foram normalizados para a intensidade média de todas as medições naquele chip. Os dados foram importados para Genespring GX11 (Agilent) para posterior análise. Os conjuntos de sondas foram selecionados se "Presente" ou "Marginal" em pelo menos 50% das amostras em qualquer grupo. A análise de componentes principais foi realizada para detectar outliers. As comparações de classe foram realizadas usando testes t após a transformação de log com a taxa de erro tipo 1 controlada usando as taxas de descoberta falsa de Benjamini-Hochberg (FDR).

Sujeitos de estudos in vivo. O estudo foi aprovado pelo Conselho de Revisão Institucional do Southwestern Medical Center da Universidade do Texas. O consentimento informado por escrito foi obtido dos pais ou responsáveis ​​legais, e o consentimento para participação foi obtido de indivíduos com 10 anos ou mais. Pacientes do Children's Medical Center Dallas com idades entre 6 e 18 anos com diabetes tipo 1 dentro de uma semana após o diagnóstico foram elegíveis. Os critérios de exclusão incluíram tratamento com corticosteroides sistêmicos ou inalatórios ou qualquer outra droga imunomoduladora, infecção ativa, história de doença micobacteriana, gravidez ou lactação, uso de uma vacina viva dentro de 90 dias da inscrição no estudo e comorbidades graves (como doença renal crônica, doença cardíaca falha ou hipertensão não controlada). Os pacientes foram excluídos se não estivesse claro se eles tinham diabetes tipo 1 ou tipo 2.

Os dados coletados dos prontuários médicos incluíram idade, sexo, raça/etnia, peso, altura, hemoglobina A1c (HbA1c) e beta-hidroxibutirato no momento do diagnóstico. Uma amostra de sangue foi obtida na entrada do estudo; uma parte foi analisada para exames laboratoriais, incluindo alanina aminotransferase (ALT), aspartato aminotransferase (AST), nitrogênio ureico no sangue (BUN), creatinina, hemograma completo (CBC) com diferencial e teste de gravidez sérico para todas as mulheres menstruadas e qualquer mulher acima 10 anos de idade. Além disso, 20 mL foram processados ​​para análise de microarray.

Cuidados com o diabetes No momento do diagnóstico, todos os indivíduos foram colocados em um regime de insulina basal-bolus com glargina e lispro ou aspart. Durante o estudo, as doses de insulina foram ajustadas de acordo com o protocolo clínico padrão com meta de glicose de 80-140 mg/dL em jejum e 80-180 mg/dL antes das refeições. Em cada visita do estudo, registramos as doses atuais de insulina e o peso do sujeito para permitir o cálculo da dose diária total (unidades/kg/dia).

Anakinra Após a inscrição no estudo, todos os indivíduos iniciaram anakinra (Kineret; Amgen, Thousand Oaks, CA) como uma injeção subcutânea diária. Indivíduos pesando mais de 25 kg no momento da inscrição receberam 100 mg diariamente, enquanto aqueles pesando 25 kg ou menos receberam 50 mg diariamente. Anakinra foi continuado por um total de 28 dias sem ajuste de dose.

Autoanticorpos para diabetes De acordo com o protocolo padrão, todos os pacientes foram testados para anticorpos contra insulina, receptor de proteína tirosina fosfatase tipo N (antígeno associado a insulinoma (IA-2)) e ácido glutâmico descarboxilase (ARUP Laboratories, Salt Lake City, UT). Os resultados desses estudos normalmente não estavam disponíveis no momento da inscrição no estudo e, portanto, não foram usados ​​como critérios para entrada no estudo. No entanto, excluímos pacientes com resultados negativos para todos os três anticorpos de análise posterior.

Exames laboratoriais de vigilância Após a conclusão da terapia com anakinra (4-5 semanas após o diagnóstico), uma amostra de sangue foi coletada e enviada para ALT, AST, BUN, creatinina e hemograma completo com diferencial. De acordo com o protocolo padrão, todos os indivíduos tiveram hemoglobina A1c no local de atendimento (DCA Vantage Analyzer, Siemens Healthcare Diagnostics, Deerfield, IL) e glicose capilar testadas em visitas clínicas 4-5 semanas após o diagnóstico, 4 meses após o diagnóstico e 7 meses após diagnóstico.

Monitoramento de eventos adversos Durante os 28 dias de terapia com anakinra, a equipe do estudo chamou os participantes semanalmente para documentar a frequência de hipoglicemia e presença de erupção cutânea, reações no local da injeção (inchaço, eritema e dor no local da administração de anakinra), dores de cabeça, febres e qualquer outros eventos adversos. Após a conclusão da terapia com anakinra, os pacientes foram avaliados quanto a eventos adversos em cada visita subsequente do estudo.

Testes de tolerância a refeições mistas (MMTTs) Os MMTTs foram conduzidos no Centro de Pesquisa Clínica Translacional (CTRC) do Southwestern Medical Center da Universidade do Texas. Os indivíduos foram submetidos a MMTTs essencialmente conforme descrito (8) em 3-4 semanas após o diagnóstico e novamente em 7 meses após o diagnóstico. As análises do peptídeo C foram realizadas no laboratório do Dr. Philip Raskin (UT Southwestern Medical Center, Dallas, TX).

Processamento de amostras de sangue Microarray As amostras de sangue Microarray foram coletadas em tubos EDTA (BD Vacutainer) no início do estudo, 3-4 semanas após o diagnóstico e após a conclusão da terapia com anakinra. As PBMC foram isoladas e armazenadas a -80°C dentro de 4 horas após a coleta de sangue. As células foram lisadas em tampão de lise RLT contendo β-mercaptoetanol (Qiagen, Valencia, CA). O RNA total foi extraído usando o RNeasy® Mini Kit de acordo com o protocolo recomendado pelo fabricante (Qiagen, Valencia, CA) e analisado conforme descrito acima.

Grupos de controle Como os indivíduos no estudo de anakinra não foram randomizados, usamos dois grupos de controle pré-existentes diferentes. Os indivíduos do grupo de controle A foram previamente inscritos em nossa instituição sob um protocolo separado, aprovado pelo IRB, em um estudo randomizado e controlado, examinando o efeito da escolha inicial de insulina de ação mais longa na taxa de perda da função das células beta. Os indivíduos foram inscritos durante a hospitalização para diagnóstico de diabetes e randomizados para receber NPH ou insulina basal (glargina ou detemir). Cuidados com o diabetes e visitas clínicas de rotina, cronograma e procedimentos para teste de tolerância a refeições mistas e análise de microarray foram os mesmos de nossos indivíduos tratados com anakinra. resultados.

Indivíduos no grupo de controle B foram identificados em uma revisão de prontuários de todos os novos diagnósticos de diabetes de abril de 2008 a novembro de 2009 em pacientes com idades entre 9 e 18 anos (para corresponder à faixa de datas de recrutamento e idade dos indivíduos tratados com anakinra). Os indivíduos foram incluídos neste grupo de controle se tivessem pelo menos um autoanticorpo positivo e não estivessem incluídos no estudo de anakinra. Coletamos idade, sexo, raça/etnia, peso, altura e beta-hidroxibutirato no momento do diagnóstico. Também coletamos a HbA1c e a dose diária total de insulina (expressa em unidades/kg/dia) no momento do diagnóstico e nas visitas clínicas 1 mês, 4 meses e 7 meses após o diagnóstico.

Um subconjunto de 10 desses indivíduos consentiu em se inscrever em um estudo aprovado pelo IRB no qual o sangue foi coletado para análise de microarray no momento do diagnóstico e novamente 1 mês após o diagnóstico. Os procedimentos de microarray foram os mesmos descritos acima para os indivíduos tratados com anakinra.

Análise estatística As estatísticas descritivas foram compiladas e todas as análises comparativas foram realizadas usando o SAS versão 9.2 (Cary, NC). A área sob a curva do peptídeo C (AUC) foi calculada para cada MMTT usando o método trapezoidal. al. (9), IDAA1c = hemoglobina A1C (porcentagem) + [4 × dose de insulina (unidades por quilograma por 24 h)]. Hemoglobina A1c e IDAA1c entre os grupos foram comparados usando testes de Wilcoxon rank-sum. Como a dose diária total de insulina foi distribuída normalmente, as comparações entre os grupos foram realizadas pelo teste t padrão.