Protizánětlivá terapie s Anakinrou u nově diagnostikovaného diabetu 1

Diabetes mellitus 1. typu (T1D) je způsoben autoimunitní a autozánětlivou destrukcí beta buněk produkujících inzulín v Langerhansových ostrůvcích slinivky břišní. Historicky se léčba tohoto stavu skládala z substituční léčby inzulínem a úpravy stravy. Nedávné studie prokázaly potenciální přínosy imunomodulační terapie u pacientů s nově diagnostikovaným T1D k prevenci dalšího imunitně zprostředkovaného poškození. Dosud bylo dokončeno jen málo dokončeného výzkumu s použitím látek, které se zaměřují na prozánětlivé cytokiny dysregulované v T1D.

IL1B, gen kódující prozánětlivý cytokin interleukin-1β (IL-1β), je významně nadměrně exprimován v mononukleárních buňkách periferní krve (PBMC) u pacientů s nově diagnostikovanou T1D ve srovnání se zdravými kontrolami. Existuje dostatek precedentů na podporu zapojení IL-1β do patogeneze diabetu. Zejména inkubace lidských nebo zvířecích ostrůvků nebo inzulinomových buněčných linií s IL-lp inhibuje sekreci inzulínu a vede k apoptóze beta buněk.

Antagonistický protein IL-1 receptoru, anakinra, navíc zlepšuje glykemickou kontrolu a kapacitu sekrece inzulínu u pacientů s diabetem 2. typu. Nebyla však publikována žádná data týkající se účinnosti látek cílených na IL-1β při modifikaci průběhu onemocnění u pacientů. s T1D. Anti-Interleukin-1 in Diabetes Action (AIDA) je randomizovaná, placebem kontrolovaná klinická studie anakinry u 160 dospělých s nově diagnostikovaným diabetem 1. typu. Tato zkouška v současné době provádí nábor subjektů. Přehled klinických zkoušek.gov demonstruje dvě další plánované studie látek IL-1 u nově diagnostikované T1D, jedna s použitím kanakinumabu, monoklonální protilátky zaměřené na IL-1p, a další s použitím rilonaceptu, cytokinové pasti cílené na IL-1p. Pro posouzení účinnosti těchto léků v budoucích studiích a v klinické praxi bude cenné identifikovat biomarkery, které nám umožní sledovat jejich terapeutické účinky. Nicméně, pokud je nám známo, vzor změn v genové expresi indukované IL-1p v normálních PBMC nebyl systematicky studován, takže je obtížné identifikovat kandidátní biomarkery pro validační studie.

V této průzkumné studii jsme se zaměřili na určení, které z charakteristických změn v genové expresi u pacientů s nově diagnostikovanou T1D jsou zprostředkované IL-1β, a to za použití in vitro i in vivo přístupů. Stanovili jsme také velikost účinku krátkého cyklu terapie anakinrou na glykemickou kontrolu, dávkování inzulínu a plochu C-peptidu pod křivkou během testování tolerance smíšeného jídla (MMTT). Nakonec jsme hodnotili snášenlivost anakinry u dětí a dospívajících s nově diagnostikovanou T1D.

Metody Studie in vitro Pro stanovení účinků IL-lp na genovou expresi v mononukleárních buňkách periferní krve (PBMC) byly odebrány vzorky krve od 7 zdravých dospělých dobrovolníků podle protokolu schváleného IRB.

Izolační sérum. Krev byla odebírána do EDTA zkumavek (BD, Franklin Lakes, NJ) a centrifugována při 2500 ot./min. po dobu 15 minut. Plazmatická vrstva byla ošetřena topickým trombinem (5000 U/ml, King Pharmaceuticals, Bristol, TN) o celkovém objemu 5 % a inkubována při 38 °C po dobu 20 minut. Výsledná sraženina byla odstraněna ze séra a zlikvidována.

Buněčná kultura. PBMC byly izolovány z buněčné frakce centrifugací za použití média pro separaci lymfocytů (Mediatech, Manassas, VA) a promyty PBS (Mediatech, Manassas, VA). Buňky byly naneseny v množství 3 x 106 na jamku na 6jamkové destičky v RPMI 1640 (Mediatech) doplněném 10% fetálním bovinním sérem (Atlanta Biologicals, Lawrenceville, GA), 10% autologním lidským sérem, 5,5 mM glukózy, 100 U penicilinu, 1 ug/ml streptomycinu, 50 umol/l 2-merkaptoethanolu a 5% HEPES. Do některých jamek byl přidán IL-lp (15 ng/ml konečná koncentrace, Abcam, Cambridge, MA) nebo 9,3 ug/ml S100b (Sigma, St. Louis, MO). Všechny experimentální podmínky byly naneseny v triplikátech. Buňky byly shromážděny po 24 hodinách inkubace při 37 °C v atmosféře 5 % C02.

Validace pomocí RT-PCR. Celková RNA byla izolována pomocí RNA-Stat 60 (Tel-Test, Friendswood, TX). K vytvoření cDNA byl použit vysokokapacitní cDNA reverzní transkripční kit (Applied Biosystems, Carlsbad, CA) se 750 ng RNA. PCR v reálném čase byla provedena na systému Roche LightCycler 480 s použitím 5 ul vzorku cDNA, soupravy Roche LightCycler Probes Master kit a lidských IL1B primerů (Applied Biosystems). RNA byla kvantifikována pomocí hodnot delta Ct s použitím GADPH jako vnitřní kontroly (Applied Biosystems).

Microarray analýza. Triplikátní vzorky pro každou experimentální podmínku byly spojeny pro další analýzu. Z 2-5 ug celkové RNA byla vytvořena dvouvláknová cDNA obsahující promotorovou sekvenci T7-dT(24) pomocí souprav GeneChip® One-Cycle cDNA Synthesis Kit (Invitrogen, Santa Clara, CA). Syntéza cRNA použila 200 ng cDNA pro in vitro transkripci, amplifikaci a kroky značení podle pokynů výrobce s použitím amplifikační soupravy Illumina RNA (Ambion Inc, Austin, TX). 1,5 ug amplifikované biotinem značené cRNA bylo následně hybridizováno s mikročipy Illumina Human HT-12 v3.0 Beadchip podle standardních protokolů. v Baylor Institute for Immunology Research, Dallas, TX.

Sklíčka byla naskenována na Illumina Beadstation 500 a data zpracována softwarem Beadstudio. Pro každý čip byla nezpracovaná data o intenzitě normalizována na průměrnou intenzitu všech měření na tomto čipu. Data byla importována do Genespring GX11 (Agilent) pro další analýzu. Sady sond byly vybrány, pokud byly "Přítomné" nebo "Okrajové" alespoň u 50 % vzorků v jakékoli skupině. Pro zjištění odlehlých hodnot byla provedena analýza hlavních složek. Srovnání tříd bylo provedeno pomocí t-testů po log transformaci s chybovostí typu 1 řízenou pomocí Benjamini-Hochberg false discovery rate (FDR).

In vivo studie Subjekty. Studie byla schválena Institutional Review Board of Texas Southwestern Medical Center. Písemný informovaný souhlas byl získán od rodičů nebo zákonných zástupců a souhlas s účastí byl získán od subjektů ve věku 10 let a starších. Pacienti z Dětského lékařského centra Dallas ve věku 6 až 18 let s diabetem 1. typu do jednoho týdne od diagnózy byli způsobilí. Kritéria vyloučení zahrnovala léčbu systémovými nebo inhalačními kortikosteroidy nebo jakýmkoli jiným imunomodulačním lékem, aktivní infekci, anamnézu mykobakteriálního onemocnění, těhotenství nebo kojení, použití živé vakcíny do 90 dnů od zařazení do studie a závažné komorbidity (jako je chronické onemocnění ledvin, srdce selhání nebo nekontrolovaná hypertenze). Pacienti byli vyloučeni, pokud nebylo jasné, zda mají diabetes 1. nebo 2. typu.

Údaje shromážděné z lékařských tabulek zahrnovaly věk, pohlaví, rasu/etnicitu, hmotnost, výšku, hemoglobin A1c (HbA1c) a beta-hydroxybutyrát v době diagnózy. Při vstupu do studie byl odebrán vzorek krve; část byla analyzována pro screeningové laboratoře včetně alaninaminotransferázy (ALT), aspartátaminotransferázy (AST), dusíku močoviny v krvi (BUN), kreatininu, kompletního krevního obrazu (CBC) s diferenciálem a těhotenského testu v séru pro všechny menstruující ženy a ženy nad věk 10 let. Navíc bylo 20 ml zpracováno pro mikročipovou analýzu.

Péče o diabetes Při diagnóze byli všichni jedinci nasazeni na bazální-bolusový inzulínový režim s glarginem a buď lispro nebo aspart. Po dobu trvání studie byly dávky inzulínu upraveny podle standardního klinického protokolu s cílovou glukózou 80-140 mg/dl nalačno a 80-180 mg/dl před jídlem. Při každé studijní návštěvě jsme zaznamenávali aktuální dávky inzulínu a hmotnost subjektu, abychom umožnili výpočet celkové denní dávky (jednotky/kg/den).

Anakinra Po zařazení do studie všichni jedinci začali užívat anakinru (Kineret; Amgen, Thousand Oaks, CA) jako subkutánní denní injekci. Subjekty s hmotností více než 25 kg v době zařazení dostávaly 100 mg denně, zatímco osoby s hmotností 25 kg nebo méně dostávaly 50 mg denně. Léčba přípravkem Anakinra pokračovala celkem 28 dní bez úpravy dávky.

Diabetes autoprotilátky Podle standardního protokolu byli všichni pacienti testováni na protilátky proti inzulínu, protein tyrosin fosfatázový receptor typu N (antigen asociovaný s inzulinomem (IA-2)) a dekarboxylázu kyseliny glutamové (ARUP Laboratories, Salt Lake City, UT). Výsledky těchto studií nebyly obvykle k dispozici v době zápisu do studia, a proto nebyly použity jako kritéria pro vstup do studia. Z další analýzy jsme však vyloučili pacienty s negativními výsledky na všechny tři protilátky.

Kontrolní laboratorní testy Po dokončení terapie anakinrou (4-5 týdnů po diagnóze) byl odebrán vzorek krve a odeslán na stanovení ALT, AST, BUN, kreatininu a CBC s diferenciálem. Podle standardního protokolu měli všichni jedinci testován hemoglobin A1c v místě péče (DCA Vantage Analyzer, Siemens Healthcare Diagnostics, Deerfield, IL) a kapilární glukóza při návštěvách kliniky 4–5 týdnů po diagnóze, 4 měsíce po diagnóze a 7 měsíců po diagnóza.

Monitorování nežádoucích účinků Během 28 dnů léčby anakinrou pracovníci studie volali subjekty týdně, aby zdokumentovali frekvenci hypoglykémie a přítomnost vyrážky, reakce v místě vpichu (otok, erytém a bolest v místě podání anakinry), bolesti hlavy, horečky a další jiné nežádoucí příhody. Po dokončení terapie anakinrou byli pacienti hodnoceni na nežádoucí účinky při každé následující návštěvě studie.

Testy tolerance smíšeného jídla (MMTT) MMTT byly provedeny na University of Texas Southwestern Medical Center Clinical Translational Research Center (CTRC). Subjekty podstoupily MMTT v podstatě tak, jak je popsáno (8) 3-4 týdny po diagnóze a znovu 7 měsíců po diagnóze. C-peptidové analýzy byly provedeny v laboratoři Dr. Philipa Raskina (UT Southwestern Medical Center, Dallas, TX).

Zpracování vzorků krve na mikročipu Vzorky krve na mikročipu byly odebírány do zkumavek EDTA (BD Vacutainer) při zařazení do studie, 3-4 týdny po diagnóze a po dokončení terapie anakinrou. PBMC byly izolovány a skladovány při -80 °C během 4 hodin od odběru krve. Buňky byly lyžovány v RLT lyzačním pufru obsahujícím p-merkaptoethanol (Qiagen, Valencia, CA). Celková RNA byla extrahována pomocí RNeasy® Mini Kit podle výrobcem doporučeného protokolu (Qiagen, Valencia, CA) a analyzována, jak je popsáno výše.

Kontrolní skupiny Protože subjekty ve studii anakinra nebyly randomizovány, použili jsme dvě různé již existující kontrolní skupiny. Subjekty v kontrolní skupině A byly dříve zařazeny v naší instituci podle samostatného protokolu schváleného IRB v randomizované, kontrolované studii zkoumající vliv počáteční volby déle působícího inzulínu na rychlost ztráty funkce beta buněk. Subjekty byly zařazeny během své hospitalizace pro diagnózu diabetu a randomizovány k podávání buď NPH nebo bazálního inzulínu (glargin nebo detemir). Péče o cukrovku a rutinní klinické návštěvy, plán a postupy pro testování tolerance smíšeného jídla a analýzu microarray byly stejné jako u našich subjektů léčených anakinrou. Kontrolní skupina A zahrnuje všechny pacienty v této studii, kteří byli randomizováni k podávání bazálního inzulínu, kromě pacientů s negativními autoprotilátkami Výsledek.

Subjekty v kontrolní skupině B byly identifikovány v přehledu tabulky všech nových diagnóz diabetu od dubna 2008 do listopadu 2009 u pacientů ve věku 9-18 let (aby odpovídalo časovému rozmezí náboru a věku subjektů léčených anakinrou). Subjekty byly zahrnuty do této kontrolní skupiny, pokud měly alespoň jednu pozitivní autoprotilátku a nebyly zařazeny do studie anakinra. Zjišťovali jsme věk, pohlaví, rasu/etnicitu, hmotnost, výšku a beta-hydroxybutyrát při diagnóze. Také jsme shromáždili HbA1c a celkovou denní dávku inzulínu (vyjádřenou v jednotkách/kg/den) při diagnóze a při návštěvách kliniky 1 měsíc, 4 měsíce a 7 měsíců po diagnóze.

Podskupina 10 z těchto subjektů souhlasila se zařazením do studie schválené IRB, ve které byla odebrána krev pro mikročipovou analýzu při diagnóze a znovu 1 měsíc po diagnóze. Mikročipové postupy byly stejné, jak je popsáno výše pro subjekty léčené anakinrou.

Statistická analýza Popisné statistiky byly sestaveny a všechny srovnávací analýzy byly provedeny pomocí SAS verze 9.2 (Cary, NC). Plocha C-peptidu pod křivkou (AUC) byla vypočtena pro každý MMTT pomocí lichoběžníkového způsobu. A1c (IDAA1c) upravená na dávku inzulínu byla vypočtena tak, jak je uvedeno v Mortensen, et. al. (9), IDAA1c = hemoglobin A1C (procenta) + [4 × dávka inzulínu (jednotky na kilogram za 24 h)]. Hemoglobin A1c a IDAA1c mezi skupinami byly porovnány pomocí Wilcoxonových rank-sum testů. Protože celková denní dávka inzulínu byla normálně rozdělena, byla mezi skupinami provedena srovnání standardním t-testem.