새로 진단된 제1형 당뇨병에서 아나킨라를 사용한 항염증 요법

제1형 진성 당뇨병(T1D)은 랑게르한스 췌도에서 인슐린 생성 베타 세포의 자가면역 및 자가염증성 파괴로 인해 발생합니다. 역사적으로 이 상태에 대한 치료는 인슐린 대체 요법과 식이 조절로 이루어졌습니다. 최근 연구에서는 새로 진단된 T1D 환자에서 추가 면역 매개 손상을 예방하기 위한 면역 조절 요법의 잠재적 이점을 입증했습니다. 지금까지 T1D에서 조절되지 않는 전 염증성 사이토카인을 표적으로 하는 제제를 사용하여 완료된 연구가 부족했습니다.

전염증성 사이토카인 인터루킨-1β(IL-1β)를 암호화하는 유전자인 IL1B는 건강한 대조군에 비해 새로 진단된 T1D 환자의 말초 혈액 단핵 세포(PBMC)에서 상당히 과발현됩니다. 당뇨병의 병인에 IL-1β가 관련되어 있음을 뒷받침하는 충분한 선례가 있습니다. 특히, 인간 또는 동물 섬 또는 인슐린종 세포주를 IL-1β와 함께 배양하면 인슐린 분비가 억제되고 베타 세포의 아폽토시스가 유도된다.

또한, IL-1 수용체 길항제 단백질인 아나킨라는 제2형 당뇨병 환자의 혈당 조절 및 인슐린 분비 능력을 향상시킵니다. T1D와 함께. AIDA(Anti-Interleukin-1 in Diabetes Action)는 새로 진단된 1형 당뇨병이 있는 성인 160명을 대상으로 아나킨라에 대한 무작위 위약 통제 임상 시험입니다. 이 시험은 현재 피험자를 모집하고 있습니다. Clinicaltrials.gov 검토 새로 진단된 T1D에서 IL-1 제제에 대한 두 가지 다른 계획된 시험을 보여줍니다. 하나는 IL-1β에 대한 단일 클론 항체인 canakinumab을 사용하고 다른 하나는 IL-1β를 표적으로 하는 사이토카인 트랩인 rilonacept를 사용합니다. 향후 연구 및 임상 실습에서 이러한 약물의 효과를 평가하려면 치료 효과를 모니터링할 수 있는 바이오마커를 식별하는 것이 중요합니다. 그러나 우리가 아는 한 정상 PBMC에서 IL-1β에 의해 ​​유도된 유전자 발현의 변화 패턴은 체계적으로 연구되지 않았기 때문에 검증 연구를 위한 후보 바이오마커를 식별하기가 어렵습니다.

이 탐색적 연구에서 우리는 시험관 내 및 생체 내 접근법을 모두 사용하여 새로 진단된 T1D 환자의 유전자 발현에서 어떤 특징적인 변화가 IL-1β 매개인지 결정하는 것을 목표로 했습니다. 우리는 또한 혼합 식사 내성 검사(MMTT) 동안 혈당 조절, 인슐린 투여량, 곡선 아래 C-펩티드 영역에 대한 아나킨라 요법의 단기 과정의 효과 크기를 결정했습니다. 마지막으로, 새로 진단된 T1D를 가진 소아 및 청소년에서 아나킨라의 내약성을 평가했습니다.

방법 In vitro 연구 말초 혈액 단핵 세포(PBMC)의 유전자 발현에 대한 IL-1β의 영향을 확인하기 위해 IRB 승인 프로토콜에 따라 7명의 건강한 성인 지원자로부터 혈액 샘플을 수집했습니다.

격리 혈청. 혈액을 EDTA 튜브(BD, Franklin Lakes, NJ)에 수집하고 2500rpm에서 15분 동안 원심분리했습니다. 혈장 층을 전체 부피의 5%에 해당하는 국소 트롬빈(5000 U/ml, King Pharmaceuticals, Bristol, TN)으로 처리하고 38°에서 20분 동안 배양했습니다. 생성된 응고물을 혈청에서 제거하고 폐기했습니다.

세포 배양. PBMC를 림프구 분리 배지(Mediatech, Manassas, VA)를 사용하여 원심분리하여 세포 분획으로부터 분리하고 PBS(Mediatech, Manassas, VA)로 세척하였다. 세포를 10% 태아 소 혈청(Atlanta Biologicals, 조지아주 로렌스빌), 10% 자가 인간 혈청, 5.5mM 포도당, 100U 페니실린, 100 μg/ml 스트렙토마이신, 50 μmol/l 2-메르캅토에탄올 및 5% HEPES. IL-1β(15 ng/ml 최종 농도, Abcam, Cambridge, MA) 또는 9.3 μg/ml S100b(Sigma, St. Louis, MO)를 일부 웰에 첨가하였다. 모든 실험 조건을 3중으로 플레이팅하였다. 세포는 5% CO2 분위기에서 37°C에서 24시간 배양 후 수집되었습니다.

RT-PCR에 의한 검증. RNA-Stat 60(Tel-Test, Friendswood, TX)을 사용하여 총 RNA를 분리하였다. 고용량 cDNA 역전사 키트(Applied Biosystems, Carlsbad, CA)를 750ng RNA와 함께 사용하여 cDNA를 생성했습니다. 5ul의 cDNA 샘플, Roche LightCycler Probes Master 키트 및 인간 IL1B 프라이머(Applied Biosystems)를 사용하여 Roche LightCycler 480 시스템에서 실시간 PCR을 수행했습니다. 내부 대조군(Applied Biosystems)으로 GADPH를 사용하여 델타 Ct 값으로 RNA를 정량화했습니다.

마이크로어레이 분석. 추가 분석을 위해 각 실험 조건에 대한 3중 샘플을 모았습니다. GeneChip® One-Cycle cDNA 합성 키트(Invitrogen, Santa Clara, CA)를 사용하여 총 RNA 2~5μg에서 T7-dT(24) 프로모터 서열을 포함하는 이중 가닥 cDNA를 생성했습니다. cRNA의 합성은 Illumina RNA 증폭 키트(Ambion Inc, Austin, TX)를 사용하여 제조업체의 지침에 따라 시험관 내 전사, 증폭 및 라벨링 단계를 위해 200ng의 cDNA를 사용했습니다. 1.5μg의 증폭된 비오틴 표지 cRNA는 이후 표준 프로토콜에 따라 Illumina Human HT-12 v3.0 Beadchip 마이크로어레이에 혼성화되었습니다. 텍사스주 댈러스에 있는 Baylor Institute for Immunology Research에서.

슬라이드는 Illumina Beadstation 500에서 스캔되었고 데이터는 Beadstudio 소프트웨어로 처리되었습니다. 각 칩에 대해 원시 강도 데이터는 해당 칩의 모든 측정값의 평균 강도로 정규화되었습니다. 추가 분석을 위해 데이터를 Genespring GX11(Agilent)로 가져왔습니다. 프로브 세트는 모든 그룹의 샘플 중 최소 50%에서 "존재" 또는 "한계"인 경우 선택되었습니다. 이상값을 탐지하기 위해 주성분 분석을 수행했습니다. 클래스 비교는 Benjamini-Hochberg 거짓 발견율(FDR)을 사용하여 제어된 유형 1 오류율로 로그 변환 후 t-테스트를 ​​사용하여 수행되었습니다.

생체 내 연구 주제. 이 연구는 University of Texas Southwestern Medical Center의 Institutional Review Board의 승인을 받았습니다. 부모 또는 법적 보호자로부터 서면 동의서를 얻었고 10세 이상의 피험자로부터 참여 동의를 얻었습니다. 진단 1주일 이내에 제1형 당뇨병을 앓고 있는 6세에서 18세 사이의 달라스 아동 의료 센터의 환자가 자격이 있었습니다. 제외 기준에는 전신 또는 흡입용 코르티코스테로이드 또는 기타 면역 조절 약물 치료, 활동성 감염, 미코박테리아 질환 병력, 임신 또는 수유, 연구 등록 90일 이내에 생백신 사용 및 중증 동반질환(예: 만성 신장 질환, 심장 실패 또는 조절되지 않는 고혈압). 제1형 당뇨병인지 제2형 당뇨병인지 확실하지 않은 환자는 제외되었습니다.

의료 차트에서 수집한 데이터에는 연령, 성별, 인종/민족, 체중, 신장, 진단 시 헤모글로빈 A1c(HbA1c) 및 베타-하이드록시부티레이트가 포함되었습니다. 연구 시작 시 혈액 샘플을 얻었습니다. ALT(alanine aminotransferase), AST(aspartate aminotransferase), 혈액요소질소(BUN), 크레아티닌, 차등적 완전혈구수(CBC), 월경 중인 모든 여성 및 모든 여성에 대한 혈청 임신 검사를 포함한 스크리닝 실험실을 위해 일부를 분석했습니다. 10세. 또한 마이크로어레이 분석을 위해 20mL를 처리했습니다.

당뇨병 관리 진단 시 모든 피험자는 글라진과 리스프로 또는 아스파트를 포함하는 기저-식전 인슐린 요법을 받았습니다. 연구 기간 동안 인슐린 용량은 공복 시 80-140mg/dL, 식전 80-180mg/dL의 목표 포도당으로 표준 클리닉 프로토콜에 따라 조정되었습니다. 각 연구 방문 시, 총 일일 용량(단위/kg/일)을 계산할 수 있도록 피험자의 현재 인슐린 용량과 체중을 기록했습니다.

아나킨라 연구 등록 후, 모든 대상자는 매일 피하 주사로 아나킨라(Kineret; Amgen, Thousand Oaks, CA)를 시작했습니다. 등록 당시 체중이 25kg 이상인 피험자는 매일 100mg을 받았고, 25kg 이하인 피험자는 매일 50mg을 받았습니다. Anakinra는 용량 조정 없이 총 28일 동안 계속되었습니다.

당뇨병 자가항체 표준 프로토콜에 따라 모든 환자는 인슐린, 단백질 티로신 포스파타제 수용체 유형 N(인슐린종 관련 항원(IA-2)) 및 글루탐산 데카르복실라제(ARUP Laboratories, Salt Lake City, UT)에 대한 항체에 대해 검사를 받았습니다. 이러한 연구의 결과는 일반적으로 연구 등록 당시에는 사용할 수 없었기 때문에 연구 등록 기준으로 사용되지 않았습니다. 그러나 세 가지 항체 모두에 대해 음성 결과가 나온 환자는 추가 분석에서 제외했습니다.

감시 실험실 테스트 아나킨라 치료 완료 시(진단 후 4-5주) 혈액 샘플을 채취하여 ALT, AST, BUN, 크레아티닌 및 감별 CBC를 위해 보냈습니다. 표준 프로토콜에 따라 모든 피험자는 진단 후 4-5주, 진단 후 4개월 및 진단 후 7개월에 진료소 방문 시 현장 헤모글로빈 A1c(DCA Vantage Analyzer, Siemens Healthcare Diagnostics, Deerfield, IL) 및 모세혈관 포도당 검사를 받았습니다. 진단.

부작용 모니터링 아나킨라 요법의 28일 동안, 연구 담당자는 저혈당의 빈도와 발진, 주사 부위 반응(아나킨라 투여 부위의 부종, 홍반 및 통증), 두통, 열 및 기타 부작용. 아나킨라 요법 완료 후, 환자는 각 후속 연구 방문에서 부작용에 대해 평가되었습니다.

혼합 식사 내성 검사(MMTT) MMTT는 텍사스 대학교 사우스웨스턴 의료 센터 CTRC(Clinical Translational Research Center)에서 수행되었습니다. 피험자는 본질적으로 진단 후 3-4주 및 진단 후 7개월에 설명된 대로 (8) MMTT를 받았습니다. C-펩티드 분석은 Dr. Philip Raskin(UT Southwestern Medical Center, Dallas, TX)의 실험실에서 수행되었습니다.

마이크로어레이 혈액 샘플 처리 마이크로어레이 혈액 샘플은 연구 등록 시, 진단 후 3-4주 및 아나킨라 요법 완료 시 EDTA 튜브(BD Vacutainer)에서 수집되었습니다. PBMC는 채혈 후 4시간 이내에 분리되어 -80°C에서 보관되었습니다. 세포를 β-머캅토에탄올(Qiagen, Valencia, CA)을 함유하는 RLT 용해 완충액에서 용해시켰다. 제조업체 권장 프로토콜(Qiagen, Valencia, CA)에 따라 RNeasy® Mini Kit를 사용하여 총 RNA를 추출하고 위에서 설명한 대로 분석했습니다.

대조군 아나킨라 연구의 대상자는 무작위 배정되지 않았기 때문에 두 개의 서로 다른 기존 대조군을 사용했습니다. 통제 그룹 A의 피험자는 이전에 베타 세포 기능 손실 속도에 대한 초기 선택의 지속성 인슐린 효과를 조사하는 무작위 통제 시험에서 별도의 IRB 승인 프로토콜에 따라 우리 기관에 등록되었습니다. 대상자는 당뇨병 진단을 위해 입원하는 동안 등록되었고 NPH 또는 기저 인슐린(글라진 또는 데터미르)을 받도록 무작위 배정되었습니다. 당뇨병 관리 및 일상적인 진료소 방문, 혼합 식사 내성 검사 및 마이크로어레이 분석을 위한 일정 및 절차는 아나킨라 치료 대상자와 동일했습니다. 대조군 A에는 기본 인슐린을 투여하도록 무작위화된 해당 연구의 모든 환자가 포함됩니다. 단, 음성 자가항체를 가진 환자는 제외됩니다. 결과.

대조군 B의 피험자는 2008년 4월부터 2009년 11월까지 9-18세 환자의 모든 새로운 당뇨병 진단 차트 검토에서 확인되었습니다(모집 날짜 범위 및 아나킨라 치료 피험자의 연령과 일치). 적어도 하나의 양성 자가항체가 있고 아나킨라 연구에 등록되지 않은 피험자는 이 대조군에 포함되었습니다. 진단 시 연령, 성별, 인종/민족, 체중, 키, 베타-하이드록시부티레이트를 수집했습니다. 또한 진단 당시와 진단 후 1개월, 4개월 및 7개월에 병원 방문을 위해 HbA1c 및 총 일일 인슐린 용량(단위/kg/일로 표시)을 수집했습니다.

이 피험자 중 10명의 하위 집합이 IRB 승인 연구에 등록하는 데 동의했습니다. 이 연구에서는 진단 시와 진단 후 다시 1개월 후에 마이크로어레이 분석을 위해 혈액을 채취했습니다. 마이크로어레이 절차는 아나킨라 처리된 피험자에 대해 위에서 설명한 것과 동일합니다.

통계 분석 기술 통계를 수집하고 모든 비교 분석을 SAS 버전 9.2(Cary, NC)를 사용하여 수행했습니다. 사다리꼴 방법을 사용하여 각 MMTT에 대해 C-펩티드 곡선하 면적(AUC)을 계산했습니다. 인슐린 용량 조정 A1c(IDAA1c)는 Mortensen, et. 알. (9), IDAA1c = 헤모글로빈 A1C(퍼센트) + [4 × 인슐린 투여량(24시간당 킬로그램 단위)]. 그룹 간의 헤모글로빈 A1c 및 IDAA1c는 Wilcoxon rank-sum 테스트를 사용하여 비교되었습니다. 총 1일 인슐린 투여량이 정상적으로 분포되었기 때문에 그룹 간 비교는 표준 t-검정으로 수행했습니다.