Autologe endoteliale stamceller (EPC'er) fra perifert blod til behandling af kritisk ekstremitetiskæmi

Type af undersøgelse. Potentielt enkelt center ikke randomiseret. Formålet med undersøgelsen. At vurdere sikkerheden, gennemførligheden og effektiviteten af ​​lokal intramuskulær administration af autologe udvalgte CD 133+-celler hos patienter, der lider af CLI.

Alle de indskrevne patienter led af CLI i henhold til TASC 2-definitionerne og havde ingen revaskulariseringsmulighed på grundlag af kontrast-CT eller angiografisk billeddannelse. Der var krævet et detaljeret informeret samtykke, godkendt af vores EU. En alder lavere end 18 år og over 70 år på grund af en dårlig marvsrespons på lægemiddelsimulering hos ældre mennesker. Klinisk ustabilitet i CLI, såsom koldbrand, der kræver større amputation og en dårlig forventet levetid, blev indført som eksklusionskriterier for formodet latens af EPCs handling. Alvorlig systemisk sygdom blev vurderet til at øge risikoen for marvstimulering. Patienter med allergisk diatese, den fødedygtige alder, tidligere EPC'er muskelimplantat, tidligere medicinsk eksperimentel protokol og enhver interessekonflikt med undersøgelsen blev udelukket.

Patienter: vi indskriver patienter med en historie med Rutherford stadium 4 (hvilesmerter) eller 5 (små iskæmiske læsioner) PAD. Alle patienterne har tidligere (kontrast-CT, MR eller angiografi) vaskulær billeddannelse eksklusiv revaskulariseringsmuligheder, både endovaskulær og åben og stødt på indskrivnings- og eksklusionskriterierne. Hver patient gennemgår rutinemæssig fysisk og instrumentel undersøgelse, herunder elektrokardiogram, røntgenbillede af thorax og blodprøveanalyse. Yngre patienter opfyldte Buergers sygdomskriterierne, mens andre havde rene aterosklerotiske læsioner.

CEUS billedbehandlingsprotokol. To operatører (F.C. og A.G., med henholdsvis 20 og 3 års erfaring), som er blindet for behandling, udfører kontrastforstærket UL for alle patienter. Der anvendes to amerikanske scannere (Philips iU22 (Bothell, WA, USA) med lineær array L9-3-transducer og GE Logiq e9 (GE Healthcare, Milwaukee, WI, USA) med lineær array L6-9-transducer.

Billeddannelsesparametrene er: reduceret sendeeffekt (mekanisk indeks <0,06), med cirka 7-10 billeder i sekundet og et fokus et godt stykke under målets niveau for at sikre et mere ensartet trykfelt. Dual-mode præsentation af et gråtonebillede side om side med kontrastbilledet letter identifikation af anatomiske strukturer i realtid og valg af ROI. Billedsløjfer på ca. 60 sekunder blev erhvervet. Der blev gjort en indsats for at have en ensartet forstærkning på tværs af billedet og for at undgå forstærkningsmætning. TGC (tidsforstærkningskompensation) blev indstillet således, at der før ankomst af kontrast blev vist et ensartet sort billede. Et hætteglas med kontrastmiddel (SonoVue BR1; Bracco, Milano, Italien) fremstilles i en koncentration på ca. 2x108 svovlhexafluoridfyldte mikrobobler pr. milliliter i henhold til producentens anbefalinger. Forud for hver injektion resuspenderes mikroboblerne ved at ryste hætteglasset. Positionen af ​​sonden registreres for hver patient for at bevare den samme position under opfølgningen. Kontrastinjektionen består af en intravenøs bolus på 4,8 ml kontrastmiddel injiceret i antecubital vene på 2 sekunder efterfulgt af en saltvandsskylning på 5 ml. Injektionen foretages med patienten på ryggen og efter 10 minutters hvile for at undgå træningsrelateret mikrovaskulær dilatation. Radiologen opretholder et konstant billedplan ved hjælp af vævet (fundamentalbilledet) i billeddannelsestilstanden "Kontrast Side/Side".

Billedanalyse. Billedsløjferne overføres til en personlig computer for yderligere analyse. De vigtigste billedanalyseopgaver er: a) identifikation af tibialis anterior arterie (TAA) område, b) udvælgelse af en repræsentativ region af normal tibialis anterior muskel (TAM) og c) formulering af tidsintensitetskurver. To manuelt definerede regioner af interesse (ROI), 2 cm og 4 cm side-firkanter, placeres henholdsvis over tibialis anterior muskel uden tegn på arterielle forgreninger, over tibialis anterior arterie og over en lille tibialis arteriel gren. ROI'erne placeres i samme anatomiske position for hver patient for at undgå uønskede forskelle under opfølgende undersøgelser. En tid/intensitetskurve (TIC) opnås for hver ROI. Fra en analyse af CEUS-tidsintensitetskurver beregner vi regional blodgennemstrømning (RBF) og volumen (RBV). Tidsintensitetskurver udtrækkes ved hjælp af kommerciel kvantificeringssoftware (QontraXt v.3.60, AMID, Rom, Italien). Denne software tillader manuel valg af interesseområde (ROI), måling af det valgte ROI-område og giver lineære data for tidsintensitetskurverne. For ROI i den normale ATM er der gjort en indsats for at placere regionen i et område uden store fartøjer. ATA'ens ROI er et kvadratisk område på 2 cm, og ATM-ROI'et er et kvadratisk område på 4 cm. Tidsintensitetskurver opnås ved at beregne den gennemsnitlige intensitet af pixels, der er omfattet af ROI'et på hvert tidspunkt. For hver billedløkke beregnes:

• RBV, som består af den samlede mængde kontrastmedier inden for det valgte ROI, i en periode. På grund af karakteristikaene for amerikanske kontrastmidler afspejler det mængden af ​​blod i et defineret område. Det er direkte relateret til arealet under kurven (AUC).
• RBF, der er i direkte forhold til perfusion i en given ROI. Det består af kontrastmediestrømmen (relateret til blodgennemstrømningen) i et valgt ROI. Det er relateret til den gennemsnitlige transittid.

Marv stimulation. Human rekombinant granulocytkolonistimulerende faktor (rhGCSF) administreres subkutant i 4-5 på hinanden følgende dage i en dosis på 10 µg/kg dagligt opdelt i 2 doser. Startende fra den tredje dag af mobilisering overvåges CD133+ celletallet dagligt ved cytofluorimetrisk analyse på en 2 ml prøve opnået fra patienternes perifere blod. Det minimale CD133+-celleantal, der er acceptabelt for leukaferese (LKF)-opsamling, var 10/µl. Patienterne overvåges for eventuelle G-CSF-relaterede bivirkninger.

Leukaferese samling. En enkelt LKF-opsamling er planlagt for hver patient ved hjælp af en tredje generation af celleseparatorenhed (Spectra Cobe, Lakewood, CO), der behandler mindst 2,5 blodvolumener i henhold til vores interne protokol for stamcelleopsamling. Patienterne overvåges for blodtryk og hjertefrekvens under hele indsamlingsproceduren. Umiddelbart efter LKF udtages en prøve fra patientens perifere blod til hæmocytometrisk analyse for at evaluere blodpladetal og Hb-niveauer. Hver leukaferesesamling fortyndes med 10% syrecitratdextrose (ACD-A) og holdes natten over ved 4°C før immunomagnetisk cellevalg. En prøve på 2 ml fra hver LKF-pose udtages til cytofluorimetrisk analyse. Fire timer efter LKF-opsamling evalueres koagulationsparametre, elektrolytniveauer og hæmocytometrisk analyse.

Immunomagnetisk cellevalg. CD133 immunomagnetiske celleudvælgelser udføres dagen efter LKF-indsamling ved hjælp af Clini-MACS (Miltenyi Biotec)-enheden i henhold til producentens standardprotokol. Kort fortalt sættes CliniMACS CD133-reagens (dannet af superparamagnetiske partikler sammensat af jernoxid og dextran konjugeret til murine monoklonale antistoffer) til cellerne til inkubation. Produktet vaskes efterfølgende ved fortynding med buffer (CliniMACS PBS-EDTA-buffer suppleret med 0,5% humant serumalbumin), og celleposen hænges på apparatet til automatisk udvælgelse af CD133-mærkede celler. En prøve på 2 ml fra den positive fraktion udtages til cytofluorimetrisk analyse.

Kvalitetskontrol. Klonogene assays. En prøve taget fra den CD133-cellepositive fraktion efter hver immunomagnetisk celleudvælgelsesprocedure podes til kortvarige (14 dage) klonogene assays. En standardblanding af methylcellulose plus rekombinant humant erythropoietin, rh stamcellefaktor (SCF), rhGM-CSF og rh interleukin-3 (IL-3) anvendes (Stem Cell Technologies, Vancouver, BC, Canada; MACS Media, Miltenyi Biotec GmbH, Bergisch Gladbach, Tyskland). Mikrobielle kulturer. Mikrobielle kulturer på immunselektionsaffaldsposen, der indeholder den negative fraktion, udføres for at påvise aerobe-anaerobe bakterier og svampekontaminering. En prøve på 10 ml inokuleres i dyrkningsmediet (Bact/Alert FA og BacT/Alert FN, Organon Teknika Corp., Durham, NC) og inkuberes i 10 dage ved 37°C.

Cytofluorimetrisk analyse. Prøver opnået fra perifert blod før mobilisering med G-CSF, på tidspunktet for leukaferese og efter immunomagnetisk celleselektion analyseres ved flowcytometri for at evaluere ekspressionen af ​​specifikke stamcelle- og endotelantigener. Becton Dickinson FACSCanto blev anvendt til alle flowcytometriske assays med en lyse no-wash-teknik ved anvendelse af følgende monoklonale antistoffer: anti-CD45 fluorescein isothiocyanat (FITC) (Becton Dickinson, San Jose, CA), anti-CD34 Peridinin-chlorophyll-protein kompleks (PerCP) (8G12 klon, Becton Dickinson), anti-CD133 phycoerythrin (PE) (AC133 klon, Miltenyi Biotec) og anti-VEGF-R2 allophycocyanin (APC) (F&U-systemer). Fuldblod behandles efter instruktionerne for VEGF-R2 (KDR) bestemmelse. Hver blodprøve overføres til et 50 ml falkerør og bringes til et samlet volumen på 30 ml ved tilsætning af ammoniumphosphatholdig lysisbuffer (Becton Dickinson). Efter en lyseringsperiode på 5 minutter centrifugeres PB ved 500 g i 5 minutter og vaskes to gange med PBS indeholdende 0,5 % bovint serumalbumin (BSA). 100 µl af hver prøve overføres derefter til et BD-rør til cytometrisk analyse og inkuberes i 15 minutter med 1 µg/105 celler IgG for at blokere alle uspecifikke steder. 50 µl af den IgG-blokerede prøve inkuberes med 20 µl anti-VEGF-R2-antistof i 30 minutter ved 4°C i mørke og vaskes derefter to gange med PBS. Ved afslutningen af ​​det sidste vasketrin tilsættes 10 µl af hvert af de andre antistoffer (anti-CD45, anti-CD34, anti-CD133) og inkuberes i 10 minutter ved stuetemperatur i mørke. Hver prøve er erhvervet med BD FACSCanto, der optager 100.000 hændelser inde i lymfocyt plus monocytporten. Datafiler analyseres med FACS Diva 6.1 software. Levedygtighed vurderes under anvendelse af 7-amino-actinomycin D (7-AAD) (Molecular Probes, Eugene, OR). En prøve til Hill og EBM2 klonogene assays tages fra patientens perifere blod før og efter mobilisering (på tidspunktet for LKF-indsamling).

Implantationsprocedure. Efter loko-regional anæstesi og kutan desinfektion under knæet administreres 45-48 ml autolog CD133+ saltvandsopløsning intramuskulært med 1 ml dyb injektion gennem 18G nål. Injektionerne blev således fordelt: 10 ml i det forreste rum af benet, 10 ml i det overfladiske bagerste rum, 10 ml i det dybe bagerste rum, 10 ml i det laterale rum og den resterende del i foden.

Baseline vurdering og opfølgning. Smertevurdering udføres med en personlig skala på 3 grader (mild, moderat og svær), og de smertestillende midler bruger monitorering. Iskæmiske læsioner behandles ugentligt af en dygtig sårbehandlingssygeplejerske. Præoperativt og 3, 6 og 12 måneder efter implantatet vurderes CEUS, læsionsudvikling og smertebehandling.