Cellules progénitrices endothéliales autologues (EPC) du sang périphérique dans le traitement de l'ischémie critique des membres

Type d'étude. Prospectif monocentrique non randomisé. Le but de l'étude. Évaluer l'innocuité, la faisabilité et l'efficacité de l'administration intramusculaire locale de cellules CD 133+ autologues sélectionnées chez des patients souffrant d'ICM.

Tous les patients inclus souffraient d'ICL selon les définitions TASC 2 et n'avaient pas d'option de revascularisation, sur la base d'un scanner de contraste ou d'une angiographie. Un consentement éclairé détaillé, approuvé par notre CE, avait été exigé. Un âge inférieur à 18 ans et supérieur à 70 ans en raison d'une faible réactivité médullaire à la simulation médicamenteuse chez les personnes âgées. L'instabilité clinique de l'ICM, telle qu'une gangrène nécessitant une amputation majeure et une faible espérance de vie ont été introduites comme critères d'exclusion pour la latence supposée de la Action de l'EPC. Une maladie systémique sévère a été jugée comme augmentant le risque de stimulation de la moelle. Les patients présentant une diathèse allergique, l'âge de procréer, un implant musculaire EPC antérieur, un protocole expérimental médical antérieur et tout conflit d'intérêt avec l'étude ont été exclus.

Patients : nous recrutons des patients ayant des antécédents de MAP de stade 4 (douleur de repos) ou 5 (petites lésions ischémiques) de Rutherford. Tous les patients avaient des antécédents d'imagerie vasculaire (scanner de contraste, IRM ou angiographie) excluant les options de revascularisation, à la fois endovasculaire et ouverte et rencontraient les critères d'inclusion et d'exclusion. Chaque patient subit un examen physique et instrumental de routine, y compris un électrocardiogramme, une radiographie pulmonaire et une analyse d'échantillon de sang. Les patients plus jeunes répondaient aux critères de la maladie de Buerger, tandis que d'autres présentaient des lésions athéroscléreuses pures.

Protocole d'imagerie CEUS. Deux opérateurs (F.C. et A.G., avec 20 et 3 ans d'expérience, respectivement) qui ne connaissent pas le traitement effectuent une échographie avec contraste pour tous les patients. Deux scanners américains (Philips iU22 (Bothell, WA, USA) avec transducteur linéaire L9-3 et GE Logiq e9 (GE Healthcare, Milwaukee, WI, USA) avec transducteur linéaire L6-9 sont utilisés.

Les paramètres d'imagerie sont : une puissance d'émission réduite (indice mécanique < 0,06), à environ 7-10 images par seconde et une mise au point bien en dessous du niveau de la cible pour assurer un champ de pression plus uniforme. La présentation en mode double d'une image en niveaux de gris côte à côte avec l'image de contraste a facilité l'identification en temps réel des structures anatomiques et la sélection du retour sur investissement. Des boucles d'images d'environ 60 secondes ont été acquises. On s'est efforcé d'avoir un gain uniforme sur toute l'image et d'éviter la saturation du gain. Le TGC (compensation de gain de temps) a été réglé de telle sorte qu'avant l'arrivée du contraste, une image noire uniforme soit affichée. Un flacon d'agent de contraste (SonoVue BR1; Bracco, Milan, Italie) est préparé à une concentration d'environ 2x108 microbulles remplies d'hexafluorure de soufre par millilitre, selon les recommandations du fabricant. Avant chaque injection, les microbulles sont remises en suspension en agitant le flacon. La position de la sonde est enregistrée pour chaque patient afin de maintenir la même position pendant le suivi. L'injection de contraste consiste en un bolus intraveineux de 4,8 ml de produit de contraste injecté dans la veine antécubitale en 2 secondes suivi d'un rinçage salin de 5 ml. L'injection est faite avec le patient en décubitus dorsal et après 10 minutes de repos pour éviter une dilatation micro-vasculaire liée à l'exercice. Le radiologue maintient un plan d'image constant à l'aide du tissu (image fondamentale) du mode d'imagerie « Contrast Side/Side ».

L'analyse d'image. Les boucles d'images sont transférées vers un ordinateur personnel pour une analyse plus approfondie. Les principales tâches d'analyse d'image sont : a) l'identification de la zone de l'artère tibiale antérieure (TAA), b) la sélection d'une région représentative du muscle tibial antérieur normal (TAM) et c) la formulation de courbes temps-intensité. Deux régions d'intérêt (ROI) définies manuellement, des carrés de 2 cm et 4 cm, sont placées, respectivement, sur le muscle tibial antérieur sans signe de branches artérielles, sur l'artère tibiale antérieure et sur une petite branche artérielle du tibial. Les ROI sont placées dans la même position anatomique pour chaque patient afin d'éviter des différences indésirables lors des examens de suivi. Une courbe temps/intensité (TIC) est obtenue pour chaque ROI. À partir d'une analyse des courbes temps-intensité CEUS, nous calculons le débit sanguin régional (RBF) et le volume (RBV). Les courbes temps-intensité sont extraites à l'aide d'un logiciel de quantification commercial (QontraXt v.3.60, AMID, Rome, Italie). Ce logiciel permet la sélection manuelle de la région d'intérêt (ROI), la mesure de la zone ROI sélectionnée et fournit des données linéaires pour les courbes temps-intensité. Pour le retour sur investissement dans l'ATM normal, un effort est fait pour placer la région dans une zone sans grands navires. Le retour sur investissement de l'ATA est une zone carrée de 2 cm et le retour sur investissement de l'ATM est une zone carrée de 4 cm. Les courbes temps-intensité sont obtenues en calculant l'intensité moyenne des pixels compris dans la ROI à chaque instant. Pour chaque boucle d'image sont calculés :

• RBV qui consiste en la quantité totale de produit de contraste dans la ROI sélectionnée, sur une période de temps. En raison des caractéristiques des produits de contraste US, il reflète la quantité de sang dans une région définie. Elle est directement liée à l'aire sous la courbe (AUC).
• RBF qui est en rapport direct avec la perfusion dans un retour sur investissement donné. Il consiste en un flux de produit de contraste (lié au flux sanguin) dans une ROI sélectionnée. Il est lié au temps de transit moyen.

Stimulation de la moelle. Le facteur de stimulation des colonies de granulocytes recombinant humain (rhGCSF) est administré par voie sous-cutanée pendant 4 à 5 jours consécutifs à une dose de 10 µg/kg par jour, fractionnée en 2 doses. A partir du troisième jour de mobilisation, la numération des cellules CD133+ est suivie quotidiennement par analyse cytofluorimétrique sur un échantillon de 2 ml prélevé sur le sang périphérique des patients. Le nombre minimal de cellules CD133+ acceptable pour la collecte par leucaphérèse (LKF) était de 10/µl. Les patients sont surveillés pour tout effet secondaire lié au G-CSF.

Collecte de leucaphérèse. Une seule collecte de LKF est prévue pour chaque patient à l'aide d'un dispositif séparateur de cellules de troisième génération (Spectra Cobe, Lakewood, CO), traitant au moins 2,5 volumes de sang selon notre protocole interne de collecte de cellules souches. Les patients sont surveillés pour la pression artérielle et la fréquence cardiaque pendant toute la procédure de collecte. Immédiatement après la LKF, un échantillon du sang périphérique du patient est prélevé pour une analyse hémocytométrique afin d'évaluer la numération plaquettaire et les taux d'Hb. Chaque collection de leucaphérèse est diluée avec du dextrose citrate acide à 10 % (ACD-A) et maintenue pendant une nuit à 4 °C avant la sélection des cellules immunomagnétiques. Un échantillon de 2 ml de chaque poche LKF est prélevé pour analyse cytofluorimétrique. Quatre heures après la collecte de LKF, les paramètres de coagulation, les niveaux d'électrolytes et l'analyse hémocytométrique sont évalués.

Sélection cellulaire immunomagnétique. Les sélections de cellules immunomagnétiques CD133 sont réalisées le lendemain du prélèvement LKF à l'aide de l'appareil Clini-MACS (Miltenyi Biotec) selon le protocole standard du fabricant. En bref, le réactif CliniMACS CD133 (formé de particules super paramagnétiques composées d'oxyde de fer et de dextrane conjugués à des anticorps monoclonaux murins) est ajouté aux cellules pour incubation. Le produit est ensuite lavé par dilution avec du tampon (tampon CliniMACS PBS-EDTA additionné de 0,5% d'albumine sérique humaine) et la poche de cellules est accrochée au dispositif de sélection automatisée des cellules marquées au CD133. Un échantillon de 2 ml de la fraction positive est prélevé pour analyse cytofluorimétrique.

Contrôles qualité. Dosages clonogéniques. Un échantillon prélevé à partir de la fraction positive de cellules CD133 après chaque procédure de sélection de cellules immunomagnétiques est ensemencé pour des essais clonogéniques à court terme (14 jours). Un mélange standard de méthylcellulose plus érythropoïétine humaine recombinante, facteur de cellules souches rh (SCF), rhGM-CSF et interleukine-3 rh (IL-3) est utilisé (Stem Cell Technologies, Vancouver, BC, Canada ; MACS Media, Miltenyi Biotec GmbH, Bergisch Gladbach, Allemagne). Cultures microbiennes. Des cultures microbiennes sur le sac à déchets d'immunosélection contenant la fraction négative sont réalisées pour détecter les bactéries aérobies-anaérobies et les contaminations fongiques. Un échantillon de 10 ml est ensemencé dans le milieu de culture (Bact/Alert FA et BacT/Alert FN, Organon Teknika Corp., Durham, NC) et incubé pendant 10 jours à 37°C.

Analyse cytofluorimétrique. Les échantillons obtenus à partir du sang périphérique avant la mobilisation avec le G-CSF, au moment de la leucaphérèse et après la sélection des cellules immunomagnétiques sont analysés par cytométrie en flux pour évaluer l'expression des cellules souches spécifiques et des antigènes endothéliaux. Becton Dickinson FACSCanto a été utilisé pour tous les tests de cytométrie en flux avec une technique de lyse sans lavage, en utilisant les anticorps monoclonaux suivants : anti-CD45 isothiocyanate de fluorescéine (FITC) (Becton Dickinson, San Jose, CA), anti-CD34 péridinine-chlorophylle-protéine (PerCP) (clone 8G12, Becton Dickinson), phycoérythrine (PE) anti-CD133 (clone AC133, Miltenyi Biotec) et allophycocyanine anti-VEGF-R2 (APC) (systèmes R&D). Le sang total est traité en suivant les instructions pour la détermination du VEGF-R2 (KDR). Chaque échantillon de sang est transféré dans un tube falcon de 50 ml et amené à un volume total de 30 ml en ajoutant du phosphate d'ammonium contenant du tampon de lyse (Becton Dickinson). Après une période de lyse de 5 minutes, le PB est centrifugé à 500 g pendant 5 minutes et lavé deux fois avec du PBS contenant 0,5 % d'albumine de sérum bovin (BSA). 100 µl de chaque échantillon sont ensuite transférés dans un tube BD pour analyse cytométrique et incubés pendant 15 minutes avec 1 µg/105 cellules IgG afin de bloquer tous les sites non spécifiques. 50 µl de l'échantillon bloqué par les IgG sont incubés avec 20 µl d'anticorps anti-VEGF-R2 pendant 30 minutes à 4°C dans l'obscurité puis lavés deux fois avec du PBS. A la fin de la dernière étape de lavage, 10 µl de chacun des autres anticorps (anti-CD45, anti-CD34, anti-CD133) sont ajoutés et incubés 10 minutes à température ambiante dans l'obscurité. Chaque échantillon est acquis avec BD FACSCanto enregistrant 100.000 événements à l'intérieur de la porte lymphocytes plus monocytes. Les fichiers de données sont analysés avec le logiciel FACS Diva 6.1. La viabilité est évaluée à l'aide de 7-amino-actinomycine D (7-AAD) (Molecular Probes, Eugene, OR). Un échantillon pour les dosages clonogéniques de Hill et EBM2 est prélevé du sang périphérique du patient avant et après la mobilisation (au moment du prélèvement LKF).

Procédure d'implantation. Après anesthésie loco-régionale et désinfection cutanée sous le genou, 45 à 48 ml de suspension de solution saline CD133+ autologue sont administrés par voie intramusculaire avec 1 ml d'injection profonde à travers une aiguille 18G. Les injections étaient ainsi réparties : 10 ml dans la loge antérieure de jambe, 10 ml dans la loge postérieure superficielle, 10 ml dans la loge postérieure profonde, 10 ml dans la loge latérale et le reste dans le pied.

Évaluation de base et suivi. L'évaluation de la douleur est réalisée avec une échelle personnelle de 3 degrés (léger, modéré et sévère) et le suivi de l'utilisation des antidouleurs. Les lésions ischémiques sont traitées chaque semaine par une infirmière qualifiée en gestion des plaies. Préopératoire et à 3, 6 et 12 mois après l'implantation sont évalués ECUS, l'évolution des lésions et la gestion de la douleur.