Perifériás vérből származó autológ endothel progenitor sejtek (EPC) a kritikus végtagi ischaemia kezelésében

A tanulmány típusa. A leendő egyetlen központ nem véletlenszerű. A tanulmány célja. Az autológ szelektált CD 133+ sejtek lokális intramuszkuláris adagolásának biztonságosságának, megvalósíthatóságának és hatékonyságának felmérése CLI-ben szenvedő betegeknél.

Valamennyi beválasztott beteg CLI-ben szenvedett a TASC 2 definíciói szerint, és kontraszt CT vagy angiográfiás képalkotás alapján nem volt lehetőségük revaszkularizációra. Részletes, tájékozott hozzájárulásra volt szükség, amelyet az Európai Bizottság jóváhagyott. 18 évnél alacsonyabb és 70 év feletti életkor, mivel a csontvelő nem reagál a gyógyszerszimulációra időseknél. A CLI klinikai bizonytalanságát, mint például a nagy amputációt igénylő gangrénát és a rossz várható élettartamot a feltételezett látencia kizáró kritériumaként vezették be. EPC akció. Úgy ítélték meg, hogy a súlyos szisztémás betegség növeli a csontvelő-stimuláció kockázatát. Az allergiás diatézisben szenvedő, fogamzóképes korú, korábbi EPC-s izomimplantátummal, korábbi orvosi kísérleti protokollal és a vizsgálattal kapcsolatos összeférhetetlenségben szenvedő betegeket kizárták.

Betegek: olyan betegeket vonunk be, akiknek a kórelőzményében Rutherford 4-es stádiumú (nyugalmi fájdalom) vagy 5-ös (kis ischaemiás elváltozások) PAD szerepel. Valamennyi betegnek volt korábbi (kontraszt CT, MR vagy angiográfia) vaszkuláris képalkotása, kizárva a revaszkularizációs lehetőségeket, mind az endovaszkuláris, mind a nyitott, és találkozott a felvételi és kizárási kritériumokkal. Minden beteg rutin fizikai és műszeres vizsgálaton esik át, beleértve az elektrokardiogramot, a mellkasröntgenet és a vérminta elemzését. A fiatalabb betegek megfeleltek a Buerger-kór kritériumainak, míg másoknak tisztán ateroszklerotikus elváltozásai voltak.

CEUS Imaging Protocol. Két operátor (F.C. és A.G., 20, illetve 3 éves tapasztalattal), akik vakok a kezelésre, minden betegnél kontrasztanyagos UH-t végeznek. Két amerikai szkennert (Philips iU22 (Bothell, WA, USA) lineáris tömb L9-3 jelátalakítóval és GE Logiq e9 (GE Healthcare, Milwaukee, WI, USA) lineáris tömb L6-9 jelátalakítóval használnak.

A képalkotási paraméterek a következők: csökkentett átviteli teljesítmény (mechanikai index <0,06), körülbelül 7-10 képkocka/másodperc sebességgel, és egy fókusszal jóval a cél szintje alatt, hogy egyenletesebb nyomásmezőt biztosítsunk. A szürkeárnyalatos kép és a kontrasztos kép melletti kettős módú megjelenítése megkönnyítette az anatómiai struktúrák valós idejű azonosítását és a ROI kiválasztását. Körülbelül 60 másodperces képhurkok készültek. Arra törekedtünk, hogy egyenletes erősítést kapjunk a képen, és elkerüljük az erősítés telítettségét. A TGC-t (time gain kompenzáció) úgy állítottuk be, hogy a kontraszt érkezése előtt egységes fekete kép jelenjen meg. Egy injekciós üveg kontrasztanyagot (SonoVue BR1; Bracco, Milánó, Olaszország) körülbelül 2x108 kén-hexafluoriddal töltött mikrobuborék/ml koncentrációban készítenek a gyártó ajánlásai szerint. Minden injekció beadása előtt a mikrobuborékokat újraszuszpendáljuk az injekciós üveg rázásával. A szonda helyzetét minden egyes betegnél rögzítik, hogy a követés során ugyanaz a pozíció maradjon. A kontrasztinjekció 4,8 ml kontrasztanyag intravénás bólusából áll, amelyet 2 másodperc alatt az antecubitalis vénába fecskendeznek be, majd 5 ml-es sóoldatot kell átöblíteni. Az injekciót a beteg hanyatt fekve és 10 perc pihenő után kell beadni, hogy elkerüljük a terheléshez kapcsolódó mikro-értágulást. A radiológus a "Contrast Side/Side" képalkotó mód szöveti (alapképe) segítségével állandó képsíkot tart fenn.

Képelemzés. A képhurkok átkerülnek egy személyi számítógépre további elemzés céljából. A fő képelemzési feladatok a következők: a) a tibialis anterior arteria (TAA) területének azonosítása, b) a normál tibialis anterior izom (TAM) reprezentatív régiójának kiválasztása és c) idő-intenzitás görbék megfogalmazása. Két kézzel definiált érdeklődési terület (ROI), 2 cm-es, illetve 4 cm-es oldalú négyzetek helyezkednek el az elülső tibialis izomzaton artériás elágazások nélkül, a tibialis anterior artéria felett és egy kis tibialis artériás ág felett. A ROI-kat minden páciensnél ugyanabba az anatómiai pozícióba helyezik, hogy elkerüljék a nem kívánt eltéréseket a követési vizsgálatok során. Minden ROI-hoz létrejön egy idő/intenzitás görbe (TIC). A CEUS idő-intenzitás görbéinek elemzéséből kiszámítjuk a regionális véráramlást (RBF) és a térfogatot (RBV). Az időintenzitás-görbéket kereskedelmi kvantifikációs szoftverrel (QontraXt v.3.60, AMID, Róma, Olaszország). Ez a szoftver lehetővé teszi az érdeklődési terület (ROI) manuális kiválasztását, a kiválasztott ROI terület mérését, és lineáris adatokat biztosít az idő-intenzitás görbékhez. A normál ATM-ben a ROI érdekében arra törekednek, hogy a régiót olyan területen helyezzék el, ahol nincsenek nagy hajók. Az ATA ROI-ja egy 2 cm-es, az ATM ROI-ja pedig egy 4 cm-es négyzetterület. Az idő-intenzitás görbéket úgy kapjuk meg, hogy kiszámítjuk a ROI-n belüli pixelek átlagos intenzitását minden időpontban. Minden képhurok kiszámítása:

• RBV, amely a kontrasztanyag teljes mennyiségéből áll a kiválasztott ROI-n belül, egy adott időszakban. Az US kontrasztanyag jellemzői miatt egy meghatározott régió vérmennyiségét tükrözi. Ez közvetlenül kapcsolódik a görbe alatti területhez (AUC).
• RBF, amely közvetlen arányban van a perfúzióval egy adott ROI-ban. Ez a kontrasztanyag áramlásából áll (a véráramláshoz kapcsolódóan) egy kiválasztott ROI-ban. Az átlagos tranzitidőhöz kapcsolódik.

Velő stimuláció. A humán rekombináns granulocita kolónia-stimuláló faktort (rhGCSF) szubkután adjuk be 4-5 egymást követő napon keresztül, napi 10 µg/kg dózisban, 2 adagra osztva. A mobilizáció harmadik napjától kezdve a betegek perifériás véréből vett 2 ml-es mintán citofluorimetriás analízissel naponta ellenőrizzük a CD133+ sejtszámot. A leukaferézis (LKF) gyűjtéshez elfogadható minimális CD133+ sejtszám 10/µl volt. A betegeket figyelemmel kísérik a G-CSF-hez kapcsolódó mellékhatások tekintetében.

Leukaferézis gyűjtemény. Minden betegnél egyetlen LKF gyűjtést tervezünk egy harmadik generációs sejtleválasztó eszközzel (Spectra Cobe, Lakewood, CO), amely legalább 2,5 vértérfogatot dolgoz fel belső őssejtgyűjtési protokollunk szerint. A betegek vérnyomását és pulzusszámát a begyűjtés teljes ideje alatt monitorozzák. Közvetlenül az LKF után mintát vesznek a páciens perifériás véréből hemocitometriás analízis céljából, hogy értékeljék a vérlemezkeszámot és a Hb-szintet. Mindegyik leukaferézis gyűjteményt 10%-os savas citrát dextrózzal (ACD-A) hígítjuk, és egy éjszakán át 4 °C-on tartjuk az immunmágneses sejtszelekció előtt. Minden LKF tasakból 2 ml-es mintát veszünk citofluorimetriás elemzéshez. Négy órával az LKF begyűjtése után értékelik a véralvadási paramétereket, az elektrolitszinteket és a hemocitometriás analízist.

Immunmágneses sejtek kiválasztása. A CD133 immunmágneses sejtszelekciót az LKF gyűjtést követő napon végezzük Clini-MACS (Miltenyi Biotec) készülékkel a gyártó szabványos protokollja szerint. Röviden: CliniMACS CD133 reagenst (amelyet vas-oxidból és egér monoklonális antitestekhez konjugált dextránból álló szuperparamágneses részecskék alkotnak) adunk a sejtekhez inkubálás céljából. A terméket ezt követően pufferrel (0,5% humán szérumalbuminnal kiegészített CliniMACS PBS-EDTA puffer) történő hígítással mossuk, és a sejtzsákot a CD133-mal jelölt sejtek automatizált szelekciójára szolgáló eszközre akasztjuk. A pozitív frakcióból 2 ml-es mintát veszünk citofluorimetriás elemzéshez.

Minőségellenőrzések. Klonogén vizsgálatok. Minden egyes immunmágneses sejtszelekciós eljárás után a CD133 sejtpozitív frakcióból vett mintát rövid távú (14 napos) klonogén vizsgálatokhoz beoltjuk. A metilcellulóz és a rekombináns humán eritropoetin, az rh őssejtfaktor (SCF), az rhGM-CSF és az rh interleukin-3 (IL-3) standard keverékét alkalmazzák (Stem Cell Technologies, Vancouver, BC, Kanada; MACS Media, Miltenyi Biotec GmbH, Bergisch Gladbach, Németország). Mikrobatenyészetek. A negatív frakciót tartalmazó immunszelekciós hulladékzsákon mikrobiális tenyészeteket végeznek az aerob-anaerob baktériumok és gombás szennyeződés kimutatására. 10 ml-es mintát oltunk be a táptalajba (Bact/Alert FA és BacT/Alert FN, Organon Teknika Corp., Durham, NC), és 10 napig 37 °C-on inkubáljuk.

Citofluorimetriás elemzés. A G-CSF-fel történő mobilizálás előtt, a leukaferézis idején és az immunmágneses sejtszelekció után a perifériás vérből vett mintákat áramlási citometriával elemezzük, hogy értékeljük a specifikus őssejt- és endoteliális antigének expresszióját. A Becton Dickinson FACSCanto-t minden áramlási citometriás vizsgálathoz alkalmazták lizáló no-wash technikával, a következő monoklonális antitestek felhasználásával: anti-CD45 fluoreszcein-izotiocianát (FITC) (Becton Dickinson, San Jose, CA), anti-CD34 Peridinin-prochlorophy komplex (PerCP) (8G12 klón, Becton Dickinson), anti-CD133 fikoeritrin (PE) (AC133 klón, Miltenyi Biotec) és anti-VEGF-R2 allophycocyanin (APC) (K+F rendszerek). A teljes vér feldolgozása a VEGF-R2 (KDR) meghatározására vonatkozó utasítások szerint történik. Minden vérmintát átviszünk egy 50 ml-es sólyomcsőbe, és ammónium-foszfátot tartalmazó lízispuffer (Becton Dickinson) hozzáadásával 30 ml össztérfogatot töltünk be. 5 perces lízisperiódus után a PB-t 500 g-vel centrifugáljuk 5 percig, és kétszer mossuk 0,5% szarvasmarha-szérumalbumint (BSA) tartalmazó PBS-sel. Ezután minden mintából 100 µl-t átviszünk egy BD-csőbe citometriás elemzés céljából, és 15 percig inkubáljuk 1 µg/105 sejt IgG-vel, hogy blokkoljuk az összes nem specifikus helyet. Az IgG-vel blokkolt minta 50 µl-ét 20 µl anti-VEGF-R2 antitesttel inkubáljuk 30 percig 4 °C-on, sötétben, majd kétszer mossuk PBS-sel. Az utolsó mosási lépés végén a többi antitestből (anti-CD45, anti-CD34, anti-CD133) 10 µl-t adunk hozzá, és 10 percig szobahőmérsékleten, sötétben inkubáljuk. Minden mintát a BD FACSCanto 100.000 felvétellel vettek fel események a limfocita plusz monocita kapun belül. Az adatfájlok elemzése a FACS Diva 6.1 szoftverrel történik. Az életképességet 7-amino-aktinomicin D (7-AAD) (Molecular Probes, Eugene, OR) alkalmazásával értékeljük. A Hill és EBM2 klonogén vizsgálatokhoz mintát vesznek a páciens perifériás véréből a mobilizálás előtt és után (az LKF gyűjtés időpontjában).

Beültetési eljárás. Loko-regionális érzéstelenítés és a térd alatti bőrfertőtlenítés után 45-48 ml autológ CD133+ sóoldat szuszpenziót adunk be intramuszkulárisan 1 ml mély injekcióval 18G tűn keresztül. Az injekciókat a következőképpen osztották el: 10 ml a láb elülső részébe, 10 ml a felszíni hátsó részbe, 10 ml a mély hátsó részbe, 10 ml az oldalsó rekeszbe és a fennmaradó rész a lábba.

Kiindulási értékelés és nyomon követés. A fájdalomértékelést 3 fokos (enyhe, közepes és súlyos) személyi skálán, valamint a fájdalomcsillapító szerek használatának monitorozásával végzik. Az ischaemiás elváltozásokat hetente egy sebkezelésben jártas nővér kezeli. A műtét előtt, valamint az implantátum beültetése után 3, 6 és 12 hónappal értékeljük a CEUS-t, a lézió alakulását és a fájdalomkezelést.