Cellule progenitrici endoteliali autologhe (EPC) da sangue periferico nel trattamento dell'ischemia critica degli arti

Tipo di studio. Singolo centro prospettico non randomizzato. Scopo dello studio. Valutare la sicurezza, la fattibilità e l'efficacia della somministrazione intramuscolare locale di cellule CD 133+ autologhe selezionate in pazienti affetti da CLI.

Tutti i pazienti arruolati erano affetti da CLI secondo le definizioni TASC 2 e non avevano alcuna opzione di rivascolarizzazione, sulla base della TC con mezzo di contrasto o dell'angiografia. Era stato richiesto un consenso informato dettagliato, approvato dalla nostra CE. Un'età inferiore a 18 anni e superiore a 70 anni a causa di una scarsa risposta del midollo alla simulazione del farmaco negli anziani Instabilità clinica del CLI, come la cancrena che richiede un'amputazione maggiore e una scarsa aspettativa di vita sono stati introdotti come criteri di esclusione per la presunta latenza del L'azione degli EPC. Si è ritenuto che una grave malattia sistemica aumentasse il rischio della stimolazione midollare. Sono stati esclusi i pazienti con diatesi allergica, età fertile, precedente impianto muscolare di EPC, precedente protocollo medico sperimentale e qualsiasi conflitto di interesse con lo studio.

Pazienti: arruoliamo pazienti con una storia di PAD allo stadio 4 di Rutherford (dolore a riposo) o 5 (piccole lesioni ischemiche). Tutti i pazienti hanno precedenti immagini vascolari (TC, RM o angiografia) che escludono le opzioni di rivascolarizzazione, sia endovascolare che aperta e hanno incontrato i criteri di arruolamento e di esclusione. Ogni paziente viene sottoposto ad esame fisico e strumentale di routine comprendente elettrocardiogramma, radiografia del torace e analisi del campione di sangue. I pazienti più giovani soddisfacevano i criteri della malattia di Buerger, mentre altri presentavano lesioni aterosclerotiche pure.

Protocollo di imaging CEUS. Due operatori (F.C. e A.G., rispettivamente con 20 e 3 anni di esperienza) in cieco rispetto al trattamento eseguono ecografie con mezzo di contrasto per tutti i pazienti. Vengono utilizzati due scanner US (Philips iU22 (Bothell, WA, USA) con trasduttore linear array L9-3 e GE Logiq e9 (GE Healthcare, Milwaukee, WI, USA) con trasduttore linear array L6-9.

I parametri di imaging sono: potenza di trasmissione ridotta (indice meccanico <0,06), a circa 7-10 fotogrammi al secondo e una messa a fuoco ben al di sotto del livello del bersaglio per garantire un campo di pressione più uniforme. La presentazione dual-mode di un'immagine in scala di grigi affiancata all'immagine di contrasto ha facilitato l'identificazione in tempo reale delle strutture anatomiche e la selezione della ROI. Sono stati acquisiti loop di immagini di circa 60 secondi. È stato fatto uno sforzo per avere un guadagno uniforme su tutta l'immagine e per evitare la saturazione del guadagno. Il TGC (compensazione del guadagno di tempo) è stato impostato in modo tale che prima dell'arrivo del contrasto fosse mostrata un'immagine nera uniforme. Una fiala di agente di contrasto (SonoVue BR1; Bracco, Milano, Italia) viene preparata a una concentrazione di circa 2x108 microbolle riempite di esafluoruro di zolfo per millilitro, secondo le raccomandazioni del produttore. Prima di ogni iniezione, le microbolle vengono risospese agitando il flaconcino. La posizione della sonda viene registrata per ogni paziente al fine di mantenere la stessa posizione durante il follow-up. L'iniezione di contrasto consiste in un bolo endovenoso di 4,8 ml di mezzo di contrasto iniettato nella vena antecubitale in 2 secondi seguito da un lavaggio con soluzione fisiologica di 5 ml. L'iniezione viene effettuata con il paziente supino e dopo 10 minuti di riposo per evitare la dilatazione microvascolare correlata all'esercizio. Il radiologo mantiene un piano dell'immagine costante con l'ausilio del tessuto (immagine fondamentale) della modalità di imaging "Contrast Side/Side".

Analisi dell'immagine. I loop di immagini vengono trasferiti su un personal computer per ulteriori analisi. I compiti principali dell'analisi dell'immagine sono: a) identificazione dell'area dell'arteria tibiale anteriore (TAA), b) selezione di una regione rappresentativa del normale muscolo tibiale anteriore (TAM) e c) formulazione di curve di intensità del tempo. Due regioni di interesse (ROI) definite manualmente, quadrati di 2 cm e 4 cm di lato, sono posizionate, rispettivamente, sopra il muscolo tibiale anteriore senza evidenza di rami arteriosi, sopra l'arteria tibiale anteriore e sopra un piccolo ramo arterioso tibiale. Le ROI sono collocate nella stessa posizione anatomica per ogni paziente per evitare differenze indesiderate durante gli esami di follow-up. Per ogni ROI si ottiene una curva tempo/intensità (TIC). Da un'analisi delle curve intensità-tempo CEUS, calcoliamo il flusso sanguigno regionale (RBF) e il volume (RBV). Le curve di intensità del tempo vengono estratte utilizzando un software di quantificazione commerciale (QontraXt v.3.60, AMI, Roma, Italia). Questo software consente la selezione manuale della regione di interesse (ROI), la misurazione dell'area ROI selezionata e fornisce dati lineari per le curve intensità-tempo. Per il ROI nel normale ATM si cerca di collocare la regione in un'area priva di grandi navi. Il ROI dell'ATA è un'area quadrata di 2 cm e il ROI ATM è un'area quadrata di 4 cm. Le curve di intensità del tempo sono ottenute calcolando l'intensità media dei pixel compresi all'interno della ROI in ogni punto temporale. Per ogni loop immagine vengono calcolati:

• RBV che consiste nella quantità totale di mezzi di contrasto all'interno della ROI selezionata, in un periodo di tempo. A causa delle caratteristiche dei mezzi di contrasto statunitensi, riflette la quantità di sangue in una regione definita. È direttamente correlato all'area sotto la curva (AUC).
• RBF che è in rapporto diretto con la perfusione in una data ROI. Consiste nel flusso del mezzo di contrasto (relativo al flusso sanguigno) in una ROI selezionata. È correlato al tempo medio di transito.

Stimolazione del midollo. Il fattore stimolante le colonie di granulociti ricombinanti umani (rhGCSF) viene somministrato per via sottocutanea per 4-5 giorni consecutivi alla dose di 10 µg/kg al giorno, suddivisa in 2 dosi. A partire dal terzo giorno di mobilizzazione, la conta delle cellule CD133+ viene monitorata giornalmente mediante analisi citofluorimetrica su un campione di 2 ml prelevato dal sangue periferico dei pazienti. La conta minima di cellule CD133+ accettabile per la raccolta della leucaferesi (LKF) era 10/µl. I pazienti vengono monitorati per qualsiasi effetto collaterale correlato al G-CSF.

Raccolta di leucaferesi. È prevista una singola raccolta LKF per ciascun paziente utilizzando un dispositivo separatore cellulare di terza generazione (Spectra Cobe, Lakewood, CO), elaborando almeno 2,5 volumi di sangue secondo il nostro protocollo interno per la raccolta di cellule staminali. I pazienti vengono monitorati per la pressione sanguigna e la frequenza cardiaca durante l'intera procedura di raccolta. Subito dopo la LKF viene prelevato un campione di sangue periferico del paziente per l'analisi emocitometrica per valutare la conta piastrinica ei livelli di Hb. Ogni raccolta di leucaferesi viene diluita con il 10% di acido citrato destrosio (ACD-A) e mantenuta per una notte a 4°C prima della selezione delle cellule immunomagnetiche. Un campione di 2 ml da ciascuna sacca LKF viene prelevato per l'analisi citofluorimetrica. Quattro ore dopo la raccolta di LKF vengono valutati i parametri di coagulazione, i livelli di elettroliti e l'analisi emocitometrica.

Selezione cellulare immunomagnetica. Le selezioni di cellule immunomagnetiche CD133 vengono eseguite il giorno dopo la raccolta di LKF utilizzando il dispositivo Clini-MACS (Miltenyi Biotec) secondo il protocollo standard del produttore. In breve, il reagente CliniMACS CD133 (formato da particelle super paramagnetiche composte da ossido di ferro e destrano coniugato ad anticorpi monoclonali murini) viene aggiunto alle cellule per l'incubazione. Il prodotto viene successivamente lavato mediante diluizione con tampone (tampone CliniMACS PBS-EDTA integrato con albumina di siero umano allo 0,5%) e la sacca di cellule viene appesa al dispositivo per la selezione automatica delle cellule marcate con CD133. Un campione di 2 ml dalla frazione positiva viene prelevato per l'analisi citofluorimetrica.

Controlli di qualità. Saggi clonogenici. Un campione prelevato dalla frazione positiva delle cellule CD133 dopo ciascuna procedura di selezione delle cellule immunomagnetiche viene seminato per analisi clonogeniche a breve termine (14 giorni). Viene impiegata una miscela standard di metilcellulosa più eritropoietina umana ricombinante, rh stem cell factor (SCF), rhGM-CSF e rh interleuchina-3 (IL-3) (Stem Cell Technologies, Vancouver, BC, Canada; MACS Media, Miltenyi Biotec GmbH, Bergisch Gladbach, Germania). Colture microbiche. Le colture microbiche sulla sacca per rifiuti di immunoselezione contenente la frazione negativa vengono eseguite per rilevare i batteri aerobi-anaerobici e la contaminazione fungina. Un campione di 10 ml viene inoculato nel terreno di coltura (Bact/Alert FA e BacT/Alert FN, Organon Teknika Corp., Durham, NC) e incubato per 10 giorni a 37°C.

Analisi citofluorimetrica. I campioni ottenuti dal sangue periferico prima della mobilizzazione con G-CSF, al momento della leucaferesi e dopo la selezione delle cellule immunomagnetiche vengono analizzati mediante citometria a flusso per valutare l'espressione di cellule staminali specifiche e antigeni endoteliali. Becton Dickinson FACSCanto è stato impiegato per tutti i saggi di citometria a flusso con una tecnica di lisi senza lavaggio, utilizzando i seguenti anticorpi monoclonali: anti-CD45 isotiocianato di fluoresceina (FITC) (Becton Dickinson, San Jose, CA), anti-CD34 Peridinina-clorofilla-proteina complesso (PerCP) (clone 8G12, Becton Dickinson), ficoeritrina anti-CD133 (PE) (clone AC133, Miltenyi Biotec) e alloficocianina anti-VEGF-R2 (APC) (sistemi di ricerca e sviluppo). Il sangue intero viene processato seguendo le istruzioni per la determinazione del VEGF-R2 (KDR). Ogni campione di sangue viene trasferito in una provetta Falcon da 50 ml e portato ad un volume totale di 30 ml aggiungendo fosfato di ammonio contenente tampone di lisi (Becton Dickinson). Dopo un periodo di lisi di 5 minuti il ​​PB viene centrifugato a 500 g per 5 minuti e lavato due volte con PBS contenente lo 0,5% di albumina di siero bovino (BSA). 100 µl di ciascun campione vengono quindi trasferiti in una provetta BD per l'analisi citometrica e incubati per 15 minuti con 1 µg/105 cellule IgG per bloccare tutti i siti non specifici. 50 µl del campione IgG bloccato vengono incubati con 20 µl di anticorpo anti-VEGF-R2 per 30 minuti a 4°C al buio e poi lavati due volte con PBS. Al termine dell'ultima fase di lavaggio, vengono aggiunti 10 µl di ciascuno degli altri anticorpi (anti-CD45, anti-CD34, anti-CD133) e incubati 10 minuti a temperatura ambiente al buio. Ogni campione viene acquisito con BD FACSCanto registrando 100.000 eventi all'interno del gate dei linfociti più dei monociti. I file di dati vengono analizzati con il software FACS Diva 6.1. La vitalità viene valutata utilizzando 7-amino-actinomicina D (7-AAD) (Molecular Probes, Eugene, OR). Un campione per i saggi clonogenici Hill ed EBM2 viene prelevato dal sangue periferico del paziente prima e dopo la mobilizzazione (al momento della raccolta LKF).

Procedura di impianto. Dopo l'anestesia loco-regionale e la disinfezione cutanea sotto il ginocchio, vengono somministrati per via intramuscolare 45-48 ml di soluzione fisiologica autologa CD133+ con iniezione profonda di 1 ml tramite ago 18G. Le iniezioni sono state così ripartite: 10 ml nel compartimento anteriore della gamba, 10 ml nel compartimento superficiale posteriore, 10 ml nel compartimento profondo posteriore, 10 ml nel compartimento laterale e la restante parte nel piede.

Valutazione di base e follow-up. Viene effettuata la valutazione del dolore con una scala personale di 3 gradi (lieve, moderata e grave) e il monitoraggio dell'uso di antidolorifici. Le lesioni ischemiche vengono trattate settimanalmente da un'infermiera esperta nella gestione delle ferite. Preoperatorio ea 3, 6 e 12 mesi dopo l'impianto vengono valutati CEUS, evoluzione della lesione e gestione del dolore.