来自外周血的自体内皮祖细胞 (EPC) 治疗严重肢体缺血

研究的类型。 前瞻性单中心未随机化。 研究的目的。 评估局部肌肉注射自体选择性 CD 133+ 细胞治疗 CLI 患者的安全性、可行性和有效性。

根据 TASC 2 定义，所有入组患者均患有 CLI，并且根据造影 CT 或血管造影成像没有血运重建选项。 需要一份由我们的 EC 批准的详细的知情同意书。 年龄低于 18 岁且高于 70 岁，因为老年人的骨髓对药物模拟的反应较差EPC 行动。 判断严重的全身性疾病会增加骨髓刺激的风险。 具有过敏体质、生育年龄、既往 EPC 肌肉植入、既往医学实验方案以及与研究有任何利益冲突的患者被排除在外。

患者：我们招募有卢瑟福 4 期（静息痛）或 5 期（小缺血性病变）PAD 病史的患者。 所有患者都曾进行过（对比 CT、MR 或血管造影）血管成像，不包括血管内和开放的血运重建选项，并符合入组和排除标准。 每位患者都接受常规体检和仪器检查，包括心电图、胸部 X 光检查和血样分析。 较年轻的患者符合 Buerger 病标准，而其他患者则有单纯的动脉粥样硬化病变。

CEUS 成像协议。 两名对治疗不知情的操作员（F.C. 和 A.G.，分别有 20 年和 3 年的经验）对所有患者进行造影增强超声。 使用两个带有线性阵列 L9-3 换能器的美国扫描仪（Philips iU22（Bothell，WA，USA）和带有线性阵列 L6-9 换能器的 GE Logiq e9（GE Healthcare，Milwaukee，WI，USA）。

成像参数是：降低发射功率（机械指数<0.06）， 以大约每秒 7-10 帧的速度，一个焦点远低于目标水平，以确保更均匀的压力场。 灰度图像与对比图像并排显示的双模式有助于解剖结构的实时识别和 ROI 选择。 获取了大约 60 秒的图像循环。 努力在整个图像上获得均匀的增益并避免增益饱和。 TGC（时间增益补偿）设置为在对比度到达之前显示均匀的黑色图像。 根据制造商的建议，一小瓶造影剂（SonoVue BR1；Bracco，意大利米兰）的制备浓度约为每毫升 2x108 个六氟化硫填充微泡。 每次注射前，通过摇动小瓶重新悬浮微泡。 记录每个患者的探头位置，以便在随访期间保持相同的位置。 造影剂注射包括在 2 秒内将 4.8 ml 造影剂静脉推注到肘前静脉，然后用 5 ml 生理盐水冲洗。 注射是在患者仰卧并休息 10 分钟后进行的，以避免运动相关的微血管扩张。 放射科医师借助“对比侧/侧”成像模式的组织（基础图像）保持恒定的图像平面。

图像分析。 图像循环被传输到个人计算机以供进一步分析。 主要图像分析任务是：a) 识别胫骨前动脉 (TAA) 区域，b) 选择正常胫骨前肌 (TAM) 的代表性区域和 c) 时间强度曲线的制定。 两个手动定义的感兴趣区域 (ROI)、2 cm 和 4 cm 边正方形分别放置在没有动脉分支证据的胫骨前肌、胫骨前动脉和小胫骨动脉分支上。 ROIs 被放置在每个患者的相同解剖位置，以避免在后续检查期间出现不必要的差异。 为每个 ROI 获得时间/强度曲线 (TIC)。 通过对 CEUS 时间强度曲线的分析，我们计算区域血流 (RBF) 和体积 (RBV)。 使用商业量化软件（QontraXt v.3.60， AMID，罗马，意大利）。 该软件允许手动选择感兴趣区域 (ROI)、测量所选 ROI 区域并为时间强度曲线提供线性数据。 对于正常 ATM 中的 ROI，努力将该区域放置在没有大型船只的区域。 ATA 的 ROI 是 2 平方厘米的区域，而 ATM 的 ROI 是 4 平方厘米的区域。 时间强度曲线是通过计算每个时间点 ROI 中包含的像素的平均强度获得的。 对于每个图像循环计算：

• RBV 包含一段时间内所选 ROI 内造影剂的总量。 由于美国造影剂的特性，它反映了特定区域的血液量。 它与曲线下面积 (AUC) 直接相关。
• RBF 在给定的 ROI 中与灌注成正比。 它包含选定 ROI 中的造影剂流（与血流相关）。 它与平均通过时间有关。

骨髓刺激。 人重组粒细胞集落刺激因子 (rhGCSF) 以每天 10 µg/kg 的剂量连续 4-5 天皮下给药，分为 2 剂。 从动员的第三天开始，每天通过对从患者外周血获得的 2 ml 样品进行细胞荧光分析来监测 CD133+ 细胞计数。 白细胞去除术 (LKF) 采集可接受的最低 CD133+ 细胞计数为 10/µl。 监测患者的任何 G-CSF 相关副作用。

白细胞去除术收集。 计划使用第三代细胞分离器设备（Spectra Cobe，莱克伍德，科罗拉多州）为每位患者收集一次 LKF，根据我们的干细胞收集内部协议处理至少 2.5 个血液体积。 在整个收集过程中监测患者的血压和心率。 在 LKF 之后，立即从患者的外周血中采集样本进行血细胞计数分析，以评估血小板计数和 Hb 水平。 每个白细胞分离收集物用 10% 酸性柠檬酸葡萄糖 (ACD-A) 稀释，并在免疫磁性细胞选择前在 4°C 下保持过夜。 从每个 LKF 袋中取出 2 毫升样品用于细胞荧光分析。 在收集 LKF 后四小时，评估凝血参数、电解质水平和血球计数分析。

免疫磁性细胞选择。 根据制造商的标准方案，使用 Clini-MACS (Miltenyi Biotec) 设备在 LKF 收集后的第二天进行 CD133 免疫磁性细胞选择。 简言之，将CliniMACS CD133试剂（由氧化铁和葡聚糖偶联鼠单克隆抗体组成的超顺磁性颗粒形成）加入细胞进行孵育。 随后通过用缓冲液（补充有 0.5% 人血清白蛋白的 CliniMACS PBS-EDTA 缓冲液）稀释来洗涤该产品，并将细胞袋挂在用于自动选择 CD133 标记细胞的设备上。 从阳性组分中取出 2 ml 样品用于细胞荧光分析。

质量控制。 克隆形成测定。 在每个免疫磁性细胞选择程序后从 CD133 细胞阳性部分中取出的样本被接种用于短期（14 天）克隆形成测定。 使用甲基纤维素加重组人促红细胞生成素、rh 干细胞因子 (SCF)、rhGM-CSF 和 rh interleukin-3 (IL-3) 的标准混合物（Stem Cell Technologies，Vancouver，BC，Canada；MACS Media，Miltenyi Biotec GmbH，贝尔吉施格拉德巴赫，德国）。 微生物培养物。 对含有阴性部分的免疫选择废物袋进行微生物培养，以检测需氧-厌氧细菌和真菌污染。 将 10ml 样品接种到培养基（Bact/Alert FA 和 BacT/Alert FN，Organon Teknika Corp.，Durham，NC）中并在 37°C 下培养 10 天。

细胞荧光分析。 在用 G-CSF 动员前、白细胞去除术时和免疫磁性细胞选择后从外周血中获得的样本通过流式细胞术进行分析，以评估特定干细胞和内皮抗原的表达。 Becton Dickinson FACSCanto 用于所有流式细胞术分析，采用裂解免洗技术，使用以下单克隆抗体：抗 CD45 异硫氰酸荧光素 (FITC)（Becton Dickinson，圣何塞，CA），抗 CD34 Peridinin-叶绿素蛋白复合物 (PerCP)（8G12 克隆，Becton Dickinson）、抗 CD133 藻红蛋白（PE）（AC133 克隆，Miltenyi Biotec）和抗 VEGF-R2 别藻蓝蛋白（APC）（R&D 系统）。 按照 VEGF-R2 (KDR) 测定说明处理全血。 将每个血样转移到 50 ml falcon 管中，并通过添加含有磷酸铵的裂解缓冲液 (Becton Dickinson) 使总体积达到 30 ml。 在 5 分钟的裂解期后，将 PB 以 500g 离心 5 分钟，并用含有 0.5% 牛血清白蛋白 (BSA) 的 PBS 洗涤两次。 然后将 100 µl 的每个样品转移到 BD 管中进行细胞计数分析，并与 1µg/105 个细胞 IgG 孵育 15 分钟以封闭所有非特异性位点。 50 µl IgG 封闭样品与 20 µl 抗 VEGF-R2 抗体在 4°C 避光孵育 30 分钟，然后用 PBS 洗涤两次。 在最后一个洗涤步骤结束时，添加 10 微升其他抗体（抗 CD45、抗 CD34、抗 CD133），并在室温下避光孵育 10 分钟。 每个样本都是通过 BD FACSCanto 记录 100.000 获得的 淋巴细胞加单核细胞门内的事件。 使用 FACS Diva 6.1 软件分析数据文件。 使用 7-氨基-放线菌素 D (7-AAD)（Molecular Probes，Eugene，OR）评估生存力。 用于 Hill 和 EBM2 克隆形成测定的样本取自动员前后（在收集 LKF 时）患者的外周血。

植入程序。 局部区域麻醉和膝下皮肤消毒后，通过18G针头深部注射1ml，肌肉注射45-48ml自体CD133+生理盐水混悬液。 注射如此分配：腿前部10ml，浅后部10ml，深部后部10ml，外侧部10ml，其余部分在足部。

基线评估和跟进。 疼痛评估采用 3 度（轻度、中度和重度）个人量表和止痛药使用监测进行。 伤口管理熟练的护士每周治疗缺血性损伤。 术前和植入后 3、6 和 12 个月评估 CEUS、病变演变和疼痛管理。