Autologiset endoteelisolut (EPC) perifeerisestä verestä kriittisen raajaiskemian hoidossa

Tutkimuksen tyyppi. Tuleva yksittäinen keskus ei satunnaistettu. Tutkimuksen tavoite. Autologisten valikoitujen CD 133+ -solujen paikallisen lihaksensisäisen annon turvallisuuden, toteutettavuuden ja tehokkuuden arvioimiseksi potilailla, jotka kärsivät CLI:stä.

Kaikki tutkimukseen otetut potilaat kärsivät CLI:stä TASC 2 -määritelmien mukaisesti, eikä heillä ollut revaskularisaatiovaihtoehtoa kontrasti-CT- tai angiografiakuvauksen perusteella. Tarvittiin yksityiskohtainen tietoinen suostumus, jonka EY:n hyväksyi. Alle 18-vuotiaat ja yli 70-vuotiaat, koska luuydin reagoi huonosti lääkesimulaatioon iäkkäillä ihmisillä. CLI:n kliininen epävakaus, kuten suurta amputaatiota vaativa kuolio ja huono elinajanodote, otettiin poissulkemiskriteereiksi oletetun latenssin perusteella. EPC:n toiminta. Vakavan systeemisen sairauden arvioitiin lisäävän luuytimen stimulaation riskiä. Potilaat, joilla oli allerginen diateesi, hedelmällisessä iässä, aiemmat EPC-lihasimplantit, aiempi lääketieteellinen kokeellinen protokolla ja kaikki eturistiriidat tutkimuksen kanssa suljettiin pois.

Potilaat: Otamme mukaan potilaita, joilla on ollut Rutherfordin vaiheen 4 (lepokipu) tai 5 (pienet iskeemiset vauriot) PAD. Kaikilla potilailla on aikaisempi verisuonikuvaus (varjokuvaus CT, MR tai angiografia), lukuun ottamatta revaskularisaatiovaihtoehtoja, sekä endovaskulaarisia että avoimia, ja he kohtasivat ilmoittautumis- ja poissulkemiskriteerit. Jokaiselle potilaalle tehdään rutiini fyysinen ja instrumentaalinen tutkimus, mukaan lukien EKG, rintakehän röntgenkuvaus ja verinäyteanalyysi. Nuoremmat potilaat täyttivät Buergerin taudin kriteerit, kun taas toisilla oli puhtaita ateroskleroottisia vaurioita.

CEUS Imaging Protocol. Kaksi operaattoria (F.C. ja A.G., joilla on vastaavasti 20 ja 3 vuoden kokemus), jotka ovat sokeutuneet hoidolle, tekevät varjoaineella tehostetun US-tutkimuksen kaikille potilaille. Käytössä on kaksi yhdysvaltalaista skanneria (Philips iU22 (Bothell, WA, USA) lineaarisen ryhmän L9-3-muuntimella ja GE Logiq e9:ää (GE Healthcare, Milwaukee, WI, USA) lineaariryhmän L6-9-anturilla.

Kuvausparametrit ovat: alennettu lähetysteho (mekaaninen indeksi <0,06), noin 7-10 kuvaa sekunnissa ja yksi tarkennus selvästi kohteen tason alapuolelle tasaisemman painekentän varmistamiseksi. Harmaasävykuvan kaksimuotoinen esitys kontrastikuvan rinnalla helpotti reaaliaikaista anatomisten rakenteiden tunnistamista ja ROI-valintaa. Noin 60 sekunnin pituisia kuvasilmukoita hankittiin. Pyrimme saamaan kuvan tasaisen vahvistuksen ja välttämään vahvistuksen kylläisyyttä. TGC (aikavahvistuksen kompensointi) asetettiin siten, että ennen kontrastin saapumista näkyi yhtenäinen musta kuva. Varjoainepullo (SonoVue BR1; Bracco, Milano, Italia) valmistetaan pitoisuudella noin 2x108 rikkiheksafluoridilla täytettyä mikrokuplaa millilitrassa valmistajan suositusten mukaisesti. Ennen jokaista injektiota mikrokuplat suspendoidaan uudelleen ravistamalla injektiopulloa. Anturin asento tallennetaan jokaiselle potilaalle, jotta se pysyy samana seurannan aikana. Varjoaineinjektio koostuu suonensisäisestä boluksesta, jossa on 4,8 ml varjoainetta, joka ruiskutetaan kyynärpäälaskimoon kahdessa sekunnissa, jota seuraa 5 ml:n suolaliuoshuuhtelu. Injektio tehdään potilaan ollessa makuuasennossa ja 10 minuutin levon jälkeen, jotta vältetään harjoitukseen liittyvä mikroverisuonilaajeneminen. Radiologi ylläpitää vakiokuvatasoa "Contrast Side/Side" -kuvaustilan kudoksen (fundamentaalikuvan) avulla.

Kuva-analyysi. Kuvasilmukat siirretään henkilökohtaiselle tietokoneelle lisäanalyysiä varten. Tärkeimmät kuva-analyysitehtävät ovat: a) tibialis anterior artery (TAA) alueen tunnistaminen, b) normaalin tibialis anterior lihaksen (TAM) edustavan alueen valinta ja c) aika-intensiteettikäyrien muotoilu. Kaksi manuaalisesti määriteltyä kiinnostuksen kohteena olevaa aluetta (ROI), 2 cm ja 4 cm:n sivuiset neliöt, asetetaan vastaavasti tibialis anterior -lihaksen päälle ilman merkkejä valtimohaaroista, tibialis anterior -valtimon yli ja pienen säärivaltimon haaran päälle. ROI:t sijoitetaan samaan anatomiseen asentoon jokaiselle potilaalle, jotta vältetään ei-toivotut erot seurantatutkimuksissa. Aika/intensiteettikäyrä (TIC) saadaan jokaiselle ROI:lle. CEUS:n aika-intensiteettikäyrien analyysistä laskemme alueellisen verenvirtauksen (RBF) ja tilavuuden (RBV). Aika-intensiteettikäyrät erotetaan kaupallisella kvantifiointiohjelmistolla (QontraXt v.3.60, AMID, Rooma, Italia). Tämä ohjelmisto mahdollistaa mielenkiintoisen alueen (ROI) valinnan manuaalisesti, valitun ROI-alueen mittaamisen ja tarjoaa lineaarista dataa aika-intensiteettikäyrille. Normaalissa ATM:ssä ROI:ta varten alue pyritään sijoittamaan alueelle, jossa ei ole suuria aluksia. ATA:n ROI on 2 cm:n neliöalue ja ATM:n ROI on 4 cm:n neliöalue. Aika-intensiteettikäyrät saadaan laskemalla ROI:n sisältämien pikselien keskimääräinen intensiteetti kullakin aikapisteellä. Kullekin kuvasilmukalle lasketaan:

• RBV, joka koostuu varjoaineiden kokonaismäärästä valitun ROI:n sisällä tietyn ajanjakson aikana. US-varjoaineiden ominaisuuksien vuoksi se heijastaa veren määrää tietyllä alueella. Se liittyy suoraan käyrän alla olevaan pinta-alaan (AUC).
• RBF, joka on suorassa suhteessa perfuusioon tietyssä ROI:ssa. Se koostuu kontrastiaineen virtauksesta (verenvirtaukseen liittyen) valitussa ROI:ssa. Se liittyy keskimääräiseen kauttakulkuaikaan.

Ytimen stimulaatio. Ihmisen rekombinanttigranulosyyttipesäkkeitä stimuloiva tekijä (rhGCSF) annetaan ihonalaisesti 4-5 peräkkäisenä päivänä annoksella 10 ug/kg päivittäin, jaettuna 2 annokseen. Kolmannesta mobilisaatiopäivästä alkaen CD133+-solujen määrää seurataan päivittäin sytofluorimetrisellä analyysillä 2 ml:n näytteestä, joka on otettu potilaiden ääreisverestä. Leukafereesin (LKF) keräämiseen hyväksyttävä CD133+-solujen vähimmäismäärä oli 10/µl. Potilaita seurataan G-CSF:ään liittyvien sivuvaikutusten varalta.

Leukafereesikokoelma. Jokaiselle potilaalle suunnitellaan yksi LKF-keräys kolmannen sukupolven soluerottimella (Spectra Cobe, Lakewood, CO), joka käsittelee vähintään 2,5 veritilavuutta kantasolujen keräämistä koskevan sisäisen protokollamme mukaisesti. Potilaiden verenpainetta ja sykettä seurataan koko keräilyn ajan. Välittömästi LKF:n jälkeen potilaan ääreisverestä otetaan näyte hemosytometriseen analyysiin verihiutaleiden määrän ja Hb-tasojen arvioimiseksi. Jokainen leukafereesikokoelma laimennetaan 10-prosenttisella happamalla sitraattidekstroosilla (ACD-A) ja sitä pidetään yön yli 4 °C:ssa ennen immunomagneettisten solujen valintaa. Jokaisesta LKF-pussista otetaan 2 ml:n näyte sytofluorimetristä analyysiä varten. Neljä tuntia LKF:n keräämisen jälkeen arvioidaan hyytymisparametrit, elektrolyyttitasot ja hemosytometrinen analyysi.

Immunomagneettisten solujen valinta. CD133-immunomagneettisten solujen valinnat suoritetaan LKF-keräyksen jälkeisenä päivänä käyttämällä Clini-MACS (Miltenyi Biotec) -laitetta valmistajan standardiprotokollan mukaisesti. Lyhyesti sanottuna CliniMACS CD133 -reagenssi (joka muodostuu superparamagneettisista hiukkasista, jotka koostuvat rautaoksidista ja dekstraanista, jotka on konjugoitu hiiren monoklonaalisiin vasta-aineisiin) lisätään soluihin inkubaatiota varten. Tämän jälkeen tuote pestään laimentamalla puskurilla (CliniMACS PBS-EDTA -puskuri, johon on lisätty 0,5 % ihmisen seerumialbumiinia) ja solupussi ripustetaan laitteeseen CD133-leimattujen solujen automaattista valintaa varten. Positiivisesta fraktiosta otetaan 2 ml:n näyte sytofluorimetristä analyysiä varten.

Laadunvalvonta. Klonogeeniset määritykset. Jokaisen immunomagneettisen solun valintamenettelyn jälkeen CD133-solupositiivisesta fraktiosta otettu näyte kylvetään lyhytaikaisia ​​(14 päivää) klonogeenisiä määrityksiä varten. Käytetään metyyliselluloosan ja ihmisen rekombinantin erytropoietiinin, rh-kantasolutekijän (SCF), rhGM-CSF:n ja rh-interleukiini-3:n (IL-3) standardiseosta (Stem Cell Technologies, Vancouver, BC, Kanada; MACS Media, Miltenyi Biotec GmbH, Bergisch Gladbach, Saksa). Mikrobiviljelmät. Negatiivisen fraktion sisältävän immunoselektiojätepussin mikrobiviljelmät suoritetaan aerobisten ja anaerobisten bakteerien ja sienikontaminaation havaitsemiseksi. 10 ml:n näyte siirrostetaan viljelyalustaan ​​(Bact/Alert FA ja BacT/Alert FN, Organon Teknika Corp., Durham, NC) ja inkuboidaan 10 päivää 37 °C:ssa.

Sytofluorimetrinen analyysi. Näytteet, jotka on otettu ääreisverestä ennen mobilisaatiota G-CSF:llä, leukafereesin aikana ja immunomagneettisen soluvalinnan jälkeen, analysoidaan virtaussytometrialla spesifisten kantasolu- ja endoteeliantigeenien ilmentymisen arvioimiseksi. Becton Dickinson FACSCantoa käytettiin kaikissa virtaussytometrisissa määrityksissä lyse no-wash -tekniikalla käyttäen seuraavia monoklonaalisia vasta-aineita: anti-CD45 fluoreseiini-isotiosyanaatti (FITC) (Becton Dickinson, San Jose, CA), anti-CD34 Peridinin-proteinphy kompleksi (PerCP) (8G12-klooni, Becton Dickinson), anti-CD133-fykoerytriini (PE) (AC133-klooni, Miltenyi Biotec) ja anti-VEGF-R2-allofykosyaniini (APC) (T&K-järjestelmät). Kokoveri käsitellään VEGF-R2 (KDR) -määrityksen ohjeiden mukaisesti. Jokainen verinäyte siirretään 50 ml:n haukkaputkeen ja saatetaan kokonaistilavuuteen 30 ml lisäämällä ammoniumfosfaattia sisältävää lyysipuskuria (Becton Dickinson). 5 minuutin lyysijakson jälkeen PB:tä sentrifugoidaan 500 g:llä 5 minuuttia ja pestään kaksi kertaa PBS:llä, joka sisältää 0,5 % naudan seerumialbumiinia (BSA). 100 ui kutakin näytettä siirretään sitten BD-putkeen sytometristä analyysiä varten ja inkuboidaan 15 minuuttia 1 ug/105 solun IgG:n kanssa kaikkien epäspesifisten kohtien estämiseksi. 50 ui IgG-salpattua näytettä inkuboidaan 20 ul:n kanssa anti-VEGF-R2-vasta-ainetta 30 minuuttia 4 °C:ssa pimeässä ja pestään sitten kahdesti PBS:llä. Viimeisen pesuvaiheen lopussa lisätään 10 ui kutakin muuta vasta-ainetta (anti-CD45, anti-CD34, anti-CD133) ja inkuboidaan 10 minuuttia huoneenlämpötilassa pimeässä. Jokainen näyte hankitaan BD FACSCantolla 100.000 tapahtumia lymfosyytti- ja monosyyttiportin sisällä. Datatiedostot analysoidaan FACS Diva 6.1 -ohjelmistolla. Elinkelpoisuus arvioidaan käyttämällä 7-aminoaktinomysiini D:tä (7-AAD) (Molecular Probes, Eugene, OR). Näyte Hill- ja EBM2-klonogeenisiä määrityksiä varten otetaan potilaan ääreisverestä ennen mobilisaatiota ja sen jälkeen (LKF-keräyksen yhteydessä).

Implantaatiomenettely. Paikallisen anestesian ja polven alapuolen ihon desinfioinnin jälkeen 45-48 ml autologista CD133+ suolaliuossuspensiota annetaan lihakseen 1 ml syväinjektiona 18G neulan kautta. Injektiot jaettiin näin: 10 ml jalan etuosastoon, 10 ml pinnalliseen takaosastoon, 10 ml syvään takaosastoon, 10 ml sivuosastoon ja loppuosa jalkaan.

Lähtötilanteen arviointi ja seuranta. Kivun arviointi suoritetaan henkilökohtaisella 3 asteen asteikolla (lievä, keskivaikea ja vaikea) ja kipulääkkeiden käytön seurannalla. Haavanhoitoon perehtynyt sairaanhoitaja hoitaa iskeemiset leesiot viikoittain. Ennen leikkausta ja 3, 6 ja 12 kuukauden kuluttua implantista arvioidaan CEUS, leesion kehitys ja kivun hallinta.