Autologní endoteliální progenitorové buňky (EPC) z periferní krve v léčbě ischemie kritické končetiny

Typ studie. Prospektivní jediné centrum není randomizováno. Cíl studie. Posoudit bezpečnost, proveditelnost a účinnost lokálního intramuskulárního podání autologních vybraných CD 133+ buněk u pacientů trpících CLI.

Všichni zařazení pacienti trpěli CLI podle definic TASC 2 a neměli možnost revaskularizace na základě kontrastního CT nebo angiografického zobrazení. Byl vyžadován podrobný informovaný souhlas schválený naší EK. Věk nižší než 18 let a vyšší než 70 let z důvodu špatné odezvy kostní dřeně na drogovou simulaci u starších lidí Klinická nestabilita CLI, jako je gangréna vyžadující velkou amputaci a nízká očekávaná délka života, byla zavedena jako vylučovací kritéria pro předpokládanou latenci onemocnění. Akce EPC. Bylo posouzeno, že závažné systémové onemocnění zvyšuje riziko stimulace kostní dřeně. Pacienti s alergickou diatézou, v plodném věku, předchozím svalovým implantátem EPC, předchozím lékařským experimentálním protokolem a jakýmkoliv konfliktem zájmů se studií byli vyloučeni.

Pacienti: zařazujeme pacienty s anamnézou Rutherfordova stadia 4 (klidová bolest) nebo 5 (malé ischemické léze) PAD. Všichni pacienti podstoupili předchozí (kontrastní CT, MR nebo angiografie) vaskulární zobrazení bez možnosti revaskularizace, endovaskulární i otevřenou, a setkali se s kritérii zařazení a vyloučení. Každý pacient absolvuje rutinní fyzikální a přístrojové vyšetření včetně elektrokardiogramu, rentgenu hrudníku a analýzy vzorku krve. Mladší pacienti splňovali kritéria Buergerovy choroby, zatímco jiní měli čisté aterosklerotické léze.

Zobrazovací protokol CEUS. Dva operátoři (F.C. a AG, se zkušenostmi 20 a 3 roky, v tomto pořadí), kteří jsou zaslepeni vůči léčbě, provádějí kontrastní ultrazvuk u všech pacientů. Jsou použity dva americké skenery (Philips iU22 (Bothell, WA, USA) s lineárním snímačem L9-3 a GE Logiq e9 (GE Healthcare, Milwaukee, WI, USA) s lineárním snímačem L6-9.

Parametry zobrazení jsou: snížený vysílací výkon (mechanický index <0,06), při přibližně 7-10 snímcích za sekundu a jedno ohnisko hluboko pod úrovní cíle, aby bylo zajištěno rovnoměrnější tlakové pole. Prezentace obrazu ve stupních šedi ve dvou režimech vedle sebe s kontrastním obrazem usnadnila identifikaci anatomických struktur a výběr ROI v reálném čase. Byly získány obrazové smyčky o délce přibližně 60 sekund. Bylo vynaloženo úsilí, aby bylo dosaženo rovnoměrného zisku v celém obrazu a aby se zabránilo nasycení zisku. TGC (kompenzace časového zisku) byla nastavena tak, aby před příchodem kontrastu byl zobrazen jednotný černý obraz. Lahvička kontrastní látky (SonoVue BR1; Bracco, Milán, Itálie) je připravena v koncentraci asi 2x108 mikrobublin naplněných fluoridem sírovým na mililitr, podle doporučení výrobce. Před každou injekcí se mikrobubliny resuspendují protřepáním lahvičky. Poloha sondy se zaznamenává pro každého pacienta, aby byla zachována stejná poloha během sledování. Kontrastní injekce sestává z intravenózního bolusu 4,8 ml kontrastní látky vstříknutého do antekubitální žíly za 2 sekundy, po kterém následuje výplach fyziologickým roztokem 5 ml. Injekce se podává pacientovi vleže na zádech a po 10 minutách klidu, aby se zabránilo mikrovaskulární dilataci související s cvičením. Radiolog udržuje konstantní rovinu obrazu pomocí tkáně (základního obrazu) v režimu zobrazení "Kontrast strana/strana".

Analýza obrazu. Obrazové smyčky jsou přeneseny do osobního počítače pro další analýzu. Hlavní úkoly analýzy obrazu jsou: a) identifikace oblasti tibialis anterior arteria (TAA), b) výběr reprezentativní oblasti normálního tibialis anterior svalu (TAM) ac) formulace křivek časové intenzity. Dvě manuálně definované oblasti zájmu (ROI), 2 cm a 4 cm boční čtverce, jsou umístěny v tomto pořadí nad musculus tibialis anterior bez známek arteriálních větví, nad arterií tibialis anterior a nad malou arteriální větví tibialis. ROI jsou umístěny ve stejné anatomické poloze pro každého pacienta, aby se předešlo nechtěným rozdílům během kontrolních vyšetření. Pro každou ROI se získá křivka čas/intenzita (TIC). Z analýzy křivek časové intenzity CEUS vypočítáme regionální průtok krve (RBF) a objem (RBV). Křivky časové intenzity jsou extrahovány pomocí komerčního kvantifikačního softwaru (QontraXt v.3.60, AMID, Řím, Itálie). Tento software umožňuje manuální výběr oblasti zájmu (ROI), měření vybrané oblasti ROI a poskytuje lineární data pro křivky časové intenzity. Pro ROI v běžném ATM je vynaloženo úsilí umístit region do oblasti bez velkých plavidel. ROI ATA je 2 cm čtvercová oblast a ATM ROI je 4 cm čtvercová oblast. Křivky časové intenzity se získají výpočtem průměrné intenzity pixelů obsažených v ROI v každém časovém bodě. Pro každou obrazovou smyčku jsou vypočteny:

• RBV, která se skládá z celkového množství kontrastní látky v rámci zvolené ROI za určité časové období. Vzhledem k vlastnostem kontrastních látek v USA odráží množství krve v definované oblasti. Přímo souvisí s plochou pod křivkou (AUC).
• RBF, která je v přímé úměře k perfuzi v dané ROI. Spočívá v průtoku kontrastního média (souvisejícího s průtokem krve) ve vybrané ROI. Souvisí se středním tranzitním časem.

Stimulace dřeně. Lidský rekombinantní faktor stimulující kolonie granulocytů (rhGCSF) se podává subkutánně po dobu 4-5 po sobě jdoucích dnů v dávce 10 ug/kg denně, rozdělené do 2 dávek. Počínaje třetím dnem mobilizace je denně monitorován počet CD133+ buněk cytofluorimetrickou analýzou na 2 ml vzorku získaného z periferní krve pacientů. Minimální počet CD133+ buněk přijatelný pro odběr leukaferézou (LKF) byl 10/ul. U pacientů se sledují jakékoli vedlejší účinky související s G-CSF.

Sbírka leukaferézy. Pro každého pacienta je plánován jeden odběr LKF pomocí zařízení na separaci buněk třetí generace (Spectra Cobe, Lakewood, CO), které zpracuje nejméně 2,5 objemu krve podle našeho interního protokolu pro odběr kmenových buněk. Během celého odběru je pacientům monitorován krevní tlak a srdeční frekvence. Bezprostředně po LKF je pacientovi odebrán vzorek periferní krve k hemocytometrické analýze ke zhodnocení počtu krevních destiček a hladin Hb. Každá sbírka leukaferézy se zředí 10% acide citrát dextrózou (ACD-A) a před imunomagnetickou buněčnou selekcí se udržuje přes noc při 4 °C. Z každého vaku LKF se odebere vzorek o objemu 2 ml pro cytofluorimetrickou analýzu. Čtyři hodiny po odběru LKF se hodnotí koagulační parametry, hladiny elektrolytů a hemocytometrická analýza.

Imunomagnetický výběr buněk. Selekce imunomagnetických buněk CD133 se provádí den po odběru LKF pomocí zařízení Clini-MACS (Miltenyi Biotec) podle standardního protokolu výrobce. Krátce, k buňkám se za účelem inkubace přidá činidlo CliniMACS CD133 (tvořené superparamagnetickými částicemi složenými z oxidu železa a dextranu konjugovaného s myšími monoklonálními protilátkami). Produkt se následně promyje zředěním pufrem (pufr CliniMACS PBS-EDTA doplněný 0,5% lidským sérovým albuminem) a vak s buňkami se zavěsí na zařízení pro automatizovanou selekci buněk značených CD133. Z pozitivní frakce se odebere vzorek o objemu 2 ml pro cytofluorimetrickou analýzu.

Kontroly kvality. Klonogenní testy. Vzorek odebraný z CD133 buněčné pozitivní frakce po každém postupu imunomagnetické selekce buněk se naočkuje pro krátkodobé (14 dní) klonogenní testy. Používá se standardní směs methylcelulózy plus rekombinantního lidského erytropoetinu, faktoru rh kmenových buněk (SCF), rhGM-CSF a rh interleukinu-3 (IL-3) (Stem Cell Technologies, Vancouver, BC, Kanada; MACS Media, Miltenyi Biotec GmbH, Bergisch Gladbach, Německo). Mikrobiální kultury. K detekci aerobně-anaerobních bakterií a plísňové kontaminace se provádějí mikrobiální kultury na vaku s imunoselekčním odpadem obsahujícím negativní frakci. Vzorek o objemu 10 ml se naočkuje do kultivačního média (Bact/Alert FA a BacT/Alert FN, Organon Teknika Corp., Durham, NC) a inkubuje se 10 dní při 37 °C.

Cytofluorimetrická analýza. Vzorky získané z periferní krve před mobilizací pomocí G-CSF, v době leukaferézy a po imunomagnetické selekci buněk jsou analyzovány průtokovou cytometrií k vyhodnocení exprese specifických kmenových buněk a endoteliálních antigenů. Becton Dickinson FACSCanto byl použit pro všechny průtokové cytometrické testy s technikou lyse no-wash s použitím následujících monoklonálních protilátek: anti-CD45 fluorescein isothiokyanát (FITC) (Becton Dickinson, San Jose, CA), anti-CD34 peridinin-chlorofyl-protein komplex (PerCP) (8G12 klon, Becton Dickinson), anti-CD133 fykoerythrin (PE) (AC133 klon, Miltenyi Biotec) a anti-VEGF-R2 allofykocyanin (APC) (R&D systems). Plná krev se zpracovává podle pokynů pro stanovení VEGF-R2 (KDR). Každý vzorek krve se přenese do 50 ml zkumavky Falcon a doplní se na celkový objem 30 ml přidáním lyzačního pufru obsahujícího fosforečnan amonný (Becton Dickinson). Po 5 minutovém období lýzy se PB odstřeďuje při 500 g po dobu 5 minut a promyje se dvakrát PBS obsahujícím 0,5% hovězí sérový albumin (BSA). 100 ul každého vzorku se poté přenese do BD zkumavky pro cytometrickou analýzu a inkubuje se 15 minut s 1 ug/105 buněk IgG, aby se zablokovala všechna nespecifická místa. 50 ul vzorku blokovaného IgG se inkubuje s 20 ul protilátky proti VEGF-R2 po dobu 30 minut při 4 °C ve tmě a poté se dvakrát promyje PBS. Na konci posledního promývacího kroku se přidá 10 ul každé z dalších protilátek (anti-CD45, anti-CD34, anti-CD133) a inkubuje se 10 minut při teplotě místnosti ve tmě. Každý vzorek je získán s BD FACSCanto záznamem 100 000 události uvnitř brány lymfocytů plus monocytů. Datové soubory jsou analyzovány pomocí softwaru FACS Diva 6.1. Životaschopnost se hodnotí pomocí 7-amino-aktinomycinu D (7-AAD) (Molecular Probes, Eugene, OR). Vzorek pro Hill a EBM2 klonogenní testy je odebrán z periferní krve pacienta před a po mobilizaci (v době odběru LKF).

Postup implantace. Po lokoregionální anestezii a dezinfekci kůže pod kolenem se intramuskulárně podá 45-48 ml suspenze autologního fyziologického roztoku CD133+ s 1 ml hlubokou injekcí jehlou 18G. Injekce byly rozděleny takto: 10 ml do předního kompartmentu nohy, 10 ml do povrchového zadního kompartmentu, 10 ml do hlubokého zadního kompartmentu, 10 ml do laterálního kompartmentu a zbývající část do chodidla.

Základní hodnocení a sledování. Hodnocení bolesti se provádí pomocí osobní stupnice 3 stupňů (mírná, střední a těžká) a sledování užívání léků proti bolesti. Ischemické léze jsou ošetřovány jednou týdně zkušenou sestrou v oblasti ošetřování ran. Před operací a 3, 6 a 12 měsíců po implantaci se hodnotí CEUS, vývoj lézí a léčba bolesti.