중증 사지 허혈 치료에서 말초 혈액의 자가 내피 전구 세포(EPC)

연구 유형. 무작위화되지 않은 유망한 단일 센터. 연구의 목표. CLI를 앓고 있는 환자에서 자가 선택 CD 133+ 세포의 국소 근육내 투여의 안전성, 실행 가능성 및 효능을 평가합니다.

등록된 모든 환자는 TASC 2 정의에 따라 CLI를 앓고 있었고 조영 CT 또는 혈관조영 영상을 기반으로 혈관재생술 옵션이 없었습니다. EC에서 승인한 자세한 정보에 입각한 동의가 필요했습니다. 노인의 약물 시뮬레이션에 대한 골수 반응이 좋지 않아 18세 미만 70세 초과 EPC 조치. 심각한 전신 질환은 골수 자극의 위험을 증가시키는 것으로 판단되었습니다. 알레르기 체질, 가임 연령, 이전 EPC 근육 임플란트, 이전 의료 실험 프로토콜 및 연구와의 이해 상충이 있는 환자는 제외되었습니다.

환자: Rutherford 4기(휴식 통증) 또는 5기(작은 허혈성 병변) PAD 병력이 있는 환자를 등록합니다. 모든 환자는 혈관재개통 옵션(혈관내 및 개방)을 제외한 이전(조영 CT, MR 또는 혈관 조영술) 혈관 영상을 가지고 있고 등록 및 제외 기준에 직면했습니다. 모든 환자는 심전도, 흉부 엑스레이 및 혈액 샘플 분석을 포함한 일상적인 신체 및 기기 검사를 받습니다. 젊은 환자는 버거병 기준을 충족한 반면 다른 환자는 순수 죽상경화성 병변이 있었습니다.

CEUS 이미징 프로토콜. 치료에 대해 눈이 먼 두 명의 조작자(각각 20년 및 3년의 경험을 가진 F.C. 및 A.G)는 모든 환자에 대해 조영 증강 초음파를 수행합니다. 선형 배열 L9-3 변환기가 있는 2개의 US 스캐너(Philips iU22(Bothell, WA, USA) 및 선형 배열 L6-9 변환기가 있는 GE Logiq e9(GE Healthcare, Milwaukee, WI, USA)가 사용됩니다.

이미징 매개변수는 전송 전력 감소(기계적 지수 <0.06), 보다 균일한 압력 필드를 보장하기 위해 초당 약 7-10 프레임 및 대상 수준보다 훨씬 낮은 하나의 초점에서. 대비 이미지와 나란히 있는 그레이스케일 이미지의 이중 모드 프레젠테이션은 해부학적 구조 및 ROI 선택의 실시간 식별을 용이하게 합니다. 약 60초의 이미지 루프가 획득되었습니다. 이미지 전체에 걸쳐 균일한 게인을 유지하고 게인 포화를 방지하기 위해 노력했습니다. TGC(시간 이득 보상)는 대비가 도달하기 전에 균일한 검은색 이미지가 표시되도록 설정되었습니다. 제조업체의 권장 사항에 따라 조영제 바이알(SonoVue BR1; Bracco, Milan, Italy)을 밀리리터당 약 2x108 육불화황으로 채워진 미세 기포의 농도로 준비합니다. 각 주입 전에 바이알을 흔들어서 미세 기포를 다시 부유시킵니다. 후속 조치 동안 동일한 위치를 유지하기 위해 각 환자에 대해 프로브의 위치가 기록됩니다. 조영제 주사는 4.8ml의 조영제를 2초 동안 전주정맥에 주입한 후 5ml의 식염수를 주입하는 정맥 주사로 구성됩니다. 운동 관련 미세혈관 확장을 피하기 위해 환자를 바로 눕히고 10분간 휴식을 취한 후 주사합니다. 방사선 전문의는 "Contrast Side/Side" 이미징 모드의 조직(기본 이미지)을 사용하여 일정한 이미지 평면을 유지합니다.

이미지 분석. 이미지 루프는 추가 분석을 위해 개인용 컴퓨터로 전송됩니다. 주요 이미지 분석 작업은 다음과 같습니다. a) 전방 경골 동맥(TAA) 영역 식별, b) 정상 전방 경골 근육(TAM)의 대표 영역 선택 및 c) 시간-강도 곡선 공식화. 2개의 수동으로 정의된 관심 영역(ROI), 2cm 및 4cm 양면 사각형이 각각 동맥 가지의 증거가 없는 전경골근 근육 위에, 전경골근 동맥 위에 그리고 작은 경골 동맥 가지 위에 배치됩니다. ROI는 후속 검사 중에 원치 않는 차이를 피하기 위해 각 환자에 대해 동일한 해부학적 위치에 배치됩니다. 각 ROI에 대해 시간/강도 곡선(TIC)을 얻습니다. CEUS 시간-강도 곡선 분석을 통해 지역 혈류(RBF) 및 체적(RBV)을 계산합니다. 상용 정량화 소프트웨어(QontraXt v.3.60, AMID, 로마, 이탈리아). 이 소프트웨어는 수동 관심 영역(ROI) 선택, 선택한 ROI 영역 측정을 허용하고 시간 강도 곡선에 대한 선형 데이터를 제공합니다. 일반 ATM의 ROI를 위해 대형 선박이 없는 지역에 지역을 배치하기 위해 노력합니다. ATA의 ROI는 2cm 정사각형 영역이고 ATM ROI는 4cm 정사각형 영역입니다. 시간 강도 곡선은 각 시점에서 ROI 내에 포함된 픽셀의 평균 강도를 계산하여 얻습니다. 각 이미지 루프는 다음과 같이 계산됩니다.

• 일정 기간 동안 선택한 ROI 내 조영제의 총량으로 구성된 RBV. 미국 조영제의 특성상 정해진 부위의 혈액량을 반영한다. 이는 곡선 아래 면적(AUC)과 직접 관련이 있습니다.
• 주어진 ROI에서 관류에 정비례하는 RBF. 선택한 ROI의 조영제 흐름(혈류 관련)으로 구성됩니다. 평균 운송 시간과 관련이 있습니다.

골수 자극. 인간 재조합 과립구 콜로니 자극 인자(rhGCSF)는 매일 10µg/kg의 용량으로 4-5일 연속 2회에 걸쳐 피하 투여됩니다. 동원 3일째부터 CD133+ 세포 수는 환자의 말초 혈액에서 얻은 2ml 샘플에 대한 세포형광 분석으로 매일 모니터링됩니다. 백혈구성분채집술(LKF) 수집에 허용되는 최소 CD133+ 세포 수는 10/µl였습니다. 모든 G-CSF 관련 부작용에 대해 환자를 모니터링합니다.

백혈구 성분채집술 수집. 줄기 세포 수집을 위한 내부 프로토콜에 따라 최소 2.5 혈액량을 처리하는 3세대 세포 분리 장치(Spectra Cobe, Lakewood, CO)를 사용하여 각 환자에 대해 단일 LKF 수집이 계획됩니다. 전체 수집 절차 동안 환자의 혈압과 심박수를 모니터링합니다. LKF 직후 환자의 말초 혈액 샘플을 채취하여 혈소판 수와 Hb 수치를 평가합니다. 각 백혈구 성분채집술 수집물은 10% acide citrate dextrose(ACD-A)로 희석하고 면역자기 세포 선택 전에 4°C에서 밤새 유지합니다. 세포형광 분석을 위해 각 LKF 백에서 2ml의 샘플을 채취합니다. LKF 수집 응고 매개변수 4시간 후, 전해질 수준 및 혈구계측 분석이 평가됩니다.

면역자기 세포 선택. 제조업체의 표준 프로토콜에 따라 Clini-MACS(Miltenyi Biotec) 장치를 사용하여 LKF 수집 다음날 CD133 면역자기 세포 선택을 수행합니다. 간략하게, CliniMACS CD133 시약(생쥐 모노클로날 항체에 접합된 산화철 및 덱스트란으로 구성된 초상자성 입자로 형성됨)을 배양을 위해 세포에 첨가합니다. 이어서 생성물을 완충액(0.5% 인간 혈청 알부민이 보충된 CliniMACS PBS-EDTA 완충액)으로 희석하여 세척하고 세포 백을 CD133 표지된 세포의 자동 선택을 위한 장치에 걸었습니다. 세포형광 분석을 위해 양성 분획에서 2ml의 샘플을 채취합니다.

품질 관리. 클론원성 분석. 각 면역자기 세포 선택 절차 후 CD133 세포 양성 분획에서 채취한 샘플을 단기(14일) 클론원성 분석을 위해 시딩합니다. 메틸셀룰로오스 + 재조합 인간 에리스로포이에틴, rh 줄기 세포 인자(SCF), rhGM-CSF 및 rh 인터루킨-3(IL-3)의 표준 혼합물이 사용됩니다(Stem Cell Technologies, Vancouver, BC, Canada; MACS Media, Miltenyi Biotec). GmbH, Bergisch Gladbach, 독일). 미생물 배양. 호기성-혐기성 세균 및 진균 오염을 검출하기 위해 음성 분획이 포함된 면역 선별 폐기물 백에서 미생물 배양을 수행합니다. 10ml 샘플을 배양 배지(Bact/Alert FA 및 BacT/Alert FN, Organon Teknika Corp., Durham, NC)에 접종하고 37°C에서 10일 동안 배양합니다.

세포형광분석. G-CSF 동원 전, 백혈구 성분채집술 시 및 면역자기 세포 선택 후 말초혈액에서 얻은 샘플을 유세포 분석기로 분석하여 특정 줄기 세포 및 내피 항원의 발현을 평가합니다. Becton Dickinson FACSCanto는 다음과 같은 단클론 항체를 사용하여 용해 무세척 기술을 사용하는 모든 유세포 분석에 사용되었습니다. 복합체(PerCP)(8G12 클론, Becton Dickinson), 항-CD133 피코에리트린(PE)(AC133 클론, Miltenyi Biotec) 및 항-VEGF-R2 알로피코시아닌(APC)(R&D 시스템). 전혈은 VEGF-R2(KDR) 측정 지침에 따라 처리됩니다. 각 혈액 샘플을 50ml 팔콘 튜브로 옮기고 용해 완충액(Becton Dickinson)이 포함된 인산암모늄을 첨가하여 총 부피를 30ml로 만듭니다. 5분의 용해 기간 후 PB를 5분 동안 500g에서 원심분리하고 0.5% 소 혈청 알부민(BSA)을 함유하는 PBS로 2회 세척합니다. 그런 다음 각 샘플 100µl를 세포 측정 분석을 위해 BD 튜브로 옮기고 모든 비특이적 부위를 차단하기 위해 1µg/105개 세포 IgG와 함께 15분 동안 배양합니다. 50μl의 IgG 차단 샘플을 20μl의 항-VEGF-R2 항체와 함께 암실에서 4°C에서 30분 동안 배양한 다음 PBS로 2회 세척합니다. 마지막 세척 단계가 끝나면 다른 항체(항-CD45, 항-CD34, 항-CD133) 각각 10μl를 첨가하고 어두운 곳에서 실온에서 10분간 배양합니다. 각 샘플은 BD FACSCanto 기록 100.000으로 수집됩니다. 림프구 플러스 단핵구 게이트 내부의 이벤트. 데이터 파일은 FACS Diva 6.1 소프트웨어로 분석됩니다. 7-아미노-악티노마이신 D(7-AAD)(Molecular Probes, Eugene, OR)를 사용하여 생존력을 평가한다. Hill 및 EBM2 clonogenic 분석을 위한 샘플은 가동화 전후(LKF 수집 시) 환자의 말초 혈액에서 채취합니다.

임플란트 절차. 국소 마취 및 무릎 아래 피부 소독 후 자가 CD133+ 식염수 현탁액 45-48ml를 18G 바늘을 통해 1ml 깊숙이 주입하여 근육 내 투여합니다. 주사는 다리의 전방 구획에 10ml, 표면 후방 구획에 10ml, 깊은 후방 구획에 10ml, 측면 구획에 10ml 및 나머지 부분은 발에 할당되었습니다.

기본 평가 및 후속 조치. 통증 평가는 3도(경증, 중등도 및 중증)의 개인 척도와 진통제 사용 모니터링으로 수행됩니다. 허혈성 병변은 숙련된 상처 관리 간호사가 매주 치료합니다. 수술 전과 이식 후 3, 6, 12개월에 CEUS, 병변 진화 및 통증 관리를 평가합니다.