Células Progenitoras Endoteliais Autólogas (CPEs) de Sangue Periférico no Tratamento de Isquemia Crítica de Membros

Tipo do estudo. Centro único prospectivo não randomizado. Objetivo do estudo. Avaliar a segurança, viabilidade e eficácia da administração intramuscular local de células CD 133+ selecionadas autólogas em pacientes que sofrem de CLI.

Todos os pacientes inscritos sofriam de CLI de acordo com as definições TASC 2 e não tinham opção de revascularização, com base em TC de contraste ou angiografia. Um consentimento informado detalhado, aprovado por nosso CE, foi exigido. Uma idade inferior a 18 anos e superior a 70 anos por causa de uma baixa capacidade de resposta da medula à simulação de drogas em idosos A instabilidade clínica do CLI, como gangrena que requer amputação maior e uma baixa expectativa de vida foram introduzidas como critérios de exclusão para suposta latência do ação de EPC. Doença sistêmica grave foi considerada como aumentando o risco de estimulação da medula. Foram excluídos pacientes com diátese alérgica, idade fértil, implante muscular de CPEs anterior, protocolo experimental médico anterior e qualquer conflito de interesse com o estudo.

Pacientes: incluímos pacientes com história de DAP estágio 4 (dor em repouso) ou 5 (pequenas lesões isquêmicas) de Rutherford. Todos os pacientes tinham imagens vasculares anteriores (TC com contraste, RM ou angiografia), excluindo as opções de revascularização, tanto endovascular quanto aberta, e atenderam aos critérios de inclusão e exclusão. Todos os pacientes passam por exame físico e instrumental de rotina, incluindo eletrocardiograma, radiografia de tórax e análise de amostra de sangue. Os pacientes mais jovens preenchiam os critérios da doença de Buerger, enquanto outros apresentavam lesões ateroscleróticas puras.

Protocolo de imagem CEUS. Dois operadores (F.C. e A.G., com 20 e 3 anos de experiência, respectivamente) cegos para o tratamento realizam US com contraste para todos os pacientes. Dois scanners US (Philips iU22 (Bothell, WA, EUA) com transdutor linear array L9-3 e GE Logiq e9 (GE Healthcare, Milwaukee, WI, EUA) com transdutor linear array L6-9 são usados.

Os parâmetros de imagem são: potência de transmissão reduzida (índice mecânico <0,06), em aproximadamente 7-10 quadros por segundo e um foco bem abaixo do nível do alvo para garantir um campo de pressão mais uniforme. A apresentação em modo duplo de uma imagem em escala de cinza lado a lado com a imagem de contraste facilitou a identificação em tempo real de estruturas anatômicas e a seleção de ROI. Loops de imagem de aproximadamente 60 segundos foram adquiridos. Foi feito um esforço para ter um ganho uniforme em toda a imagem e evitar a saturação do ganho. O TGC (compensação de ganho de tempo) foi definido de forma que, antes da chegada do contraste, uma imagem preta uniforme fosse exibida. Um frasco de agente de contraste (SonoVue BR1; Bracco, Milão, Itália) é preparado na concentração de cerca de 2x108 microbolhas cheias de hexafluoreto de enxofre por mililitro, de acordo com as recomendações do fabricante. Antes de cada injeção, as microbolhas são ressuspensas agitando o frasco. A posição da sonda é registrada para cada paciente, a fim de manter a mesma posição durante o acompanhamento. A injeção de contraste consiste em um bolus intravenoso de 4,8 ml de agente de contraste injetado na veia antecubital em 2 segundos, seguido de uma injeção de solução salina de 5 ml. A injeção é feita com o paciente em decúbito dorsal e após 10 minutos de repouso para evitar a dilatação microvascular relacionada ao exercício. O radiologista mantém um plano de imagem constante com o auxílio do tecido (imagem fundamental) do modo de imagem "Contrast Side/Side".

Análise de imagem. Os loops de imagem são transferidos para um computador pessoal para análise posterior. As principais tarefas de análise de imagem são: a) identificação da área da artéria tibial anterior (TAA), b) seleção de uma região representativa do músculo tibial anterior normal (TAM) ec) formulação de curvas tempo-intensidade. Duas regiões de interesse (ROI) definidas manualmente, quadrados de 2 cm e 4 cm de lado, são colocadas, respectivamente, sobre o músculo tibial anterior sem evidência de ramos arteriais, sobre a artéria tibial anterior e sobre um pequeno ramo arterial tibial. As ROIs são colocadas na mesma posição anatômica para cada paciente para evitar diferenças indesejadas durante os exames de acompanhamento. Uma curva de tempo/intensidade (TIC) é obtida para cada ROI. A partir de uma análise das curvas de tempo-intensidade do CEUS, calculamos o fluxo sanguíneo regional (RBF) e o volume (RBV). As curvas de intensidade de tempo são extraídas usando software de quantificação comercial (QontraXt v.3.60, AMID, Roma, Itália). Este software permite a seleção manual da região de interesse (ROI), medição da área ROI selecionada e fornece dados lineares para as curvas de intensidade de tempo. Para o ROI no ATM normal é feito um esforço para colocar a região em uma área sem grandes embarcações. O ROI do ATA é uma área quadrada de 2 cm e o ROI ATM é uma área quadrada de 4 cm. As curvas de tempo-intensidade são obtidas computando-se a intensidade média dos pixels contidos na ROI em cada ponto no tempo. Para cada loop de imagem são calculados:

• RBV que consiste na quantidade total de meio de contraste dentro da ROI selecionada, em um período de tempo. Devido às características do meio de contraste do US, ele reflete a quantidade de sangue em uma região definida. Está diretamente relacionado com a área sob a curva (AUC).
• RBF que está em proporção direta com a perfusão em um determinado ROI. Consiste no fluxo do meio de contraste (relacionado ao fluxo sanguíneo) em uma ROI selecionada. Está relacionado com o Tempo Médio de Trânsito.

Estimulação medular. O fator estimulador de colônias de granulócitos recombinantes humanos (rhGCSF) é administrado por via subcutânea por 4-5 dias consecutivos em uma dosagem de 10 µg/kg diariamente, dividida em 2 doses. A partir do terceiro dia de mobilização, a contagem de células CD133+ é monitorada diariamente por análise citofluorimétrica em uma amostra de 2 ml obtida do sangue periférico dos pacientes. A contagem mínima de células CD133+ aceitável para coleta de leucaférese (LKF) foi de 10/µl. Os pacientes são monitorados quanto a quaisquer efeitos colaterais relacionados ao G-CSF.

Coleta de leucaférese. Uma única coleta de LKF é planejada para cada paciente usando um dispositivo separador de células de terceira geração (Spectra Cobe, Lakewood, CO), processando pelo menos 2,5 volumes de sangue de acordo com nosso protocolo interno para coleta de células-tronco. Os pacientes são monitorados quanto à pressão arterial e frequência cardíaca durante todo o procedimento de coleta. Imediatamente após LKF, uma amostra de sangue periférico do paciente é coletada para análise hemocitométrica para avaliar a contagem de plaquetas e os níveis de Hb. Cada coleção de leucaferese é diluída com 10% de ácido citrato dextrose (ACD-A) e mantida durante a noite a 4°C antes da seleção de células imunomagnéticas. Uma amostra de 2 ml de cada bolsa LKF é retirada para análise citofluorimétrica. Quatro horas após a coleta de LKF, parâmetros de coagulação, níveis de eletrólitos e análise hemocitométrica são avaliados.

Seleção celular imunomagnética. As seleções de células imunomagnéticas CD133 são realizadas no dia seguinte à coleta de LKF usando o dispositivo Clini-MACS (Miltenyi Biotec) de acordo com o protocolo padrão do fabricante. Resumidamente, o reagente CliniMACS CD133 (formado por partículas superparamagnéticas compostas de óxido de ferro e dextrano conjugado a anticorpos monoclonais murinos) é adicionado às células para incubação. O produto é subsequentemente lavado por diluição com tampão (tampão CliniMACS PBS-EDTA suplementado com 0,5% de albumina de soro humano) e o saco de células é pendurado no dispositivo para a seleção automática de células marcadas com CD133. Uma amostra de 2 ml da fração positiva é retirada para análise citofluorimétrica.

Controles de qualidade. Ensaios clonogênicos. Uma amostra retirada da fração positiva de células CD133 após cada procedimento de seleção de células imunomagnéticas é semeada para ensaios clonogênicos de curto prazo (14 dias). Uma mistura padrão de metilcelulose mais eritropoietina humana recombinante, fator de células-tronco rh (SCF), rhGM-CSF e rh interleucina-3 (IL-3) é empregada (Stem Cell Technologies, Vancouver, BC, Canadá; MACS Media, Miltenyi Biotec GmbH, Bergisch Gladbach, Alemanha). Culturas microbianas. Culturas microbianas no saco de resíduos de imunosseleção contendo a fração negativa são realizadas para detectar bactérias aeróbicas-anaeróbicas e contaminação fúngica. Uma amostra de 10ml é inoculada no meio de cultura (Bact/Alert FA e BacT/Alert FN, Organon Teknika Corp., Durham, NC) e incubada por 10 dias a 37°C.

Análise citofluorimétrica. Amostras obtidas de sangue periférico antes da mobilização com G-CSF, no momento da leucaferese e após a seleção de células imunomagnéticas são analisadas por citometria de fluxo para avaliar a expressão de células-tronco específicas e antígenos endoteliais. Becton Dickinson FACSCanto foi empregado para todos os ensaios de citometria de fluxo com uma técnica de lise sem lavagem, usando os seguintes anticorpos monoclonais: isotiocianato de fluoresceína anti-CD45 (FITC) (Becton Dickinson, San Jose, CA), anti-CD34 Peridinina-clorofila-proteína complexo (PerCP) (clone 8G12, Becton Dickinson), ficoeritrina anti-CD133 (PE) (clone AC133, Miltenyi Biotec) e aloficocianina anti-VEGF-R2 (APC) (sistemas de P&D). O sangue total é processado seguindo as instruções para determinação de VEGF-R2 (KDR). Cada amostra de sangue é transferida para um tubo falcon de 50 ml e levado a um volume total de 30 ml por adição de fosfato de amônio contendo tampão de lise (Becton Dickinson). Após um período de lise de 5 minutos, o PB é centrifugado a 500g por 5 minutos e lavado duas vezes com PBS contendo 0,5% de albumina de soro bovino (BSA). 100 µl de cada amostra são então transferidos para um tubo BD para análise citométrica e incubados por 15 minutos com 1 µg/105 células IgG para bloquear todos os locais inespecíficos. 50 µl da amostra bloqueada por IgG são incubados com 20 µl de anticorpo anti-VEGF-R2 durante 30 minutos a 4°C no escuro e depois lavados duas vezes com PBS. No final da última etapa de lavagem, 10 µl de cada um dos outros anticorpos (anti-CD45, anti-CD34, anti-CD133) são adicionados e incubados 10 minutos à temperatura ambiente no escuro. Cada amostra é adquirida com BD FACSCanto gravando 100.000 eventos dentro do portão de linfócitos mais monócitos. Os arquivos de dados são analisados ​​com o software FACS Diva 6.1. A viabilidade é avaliada usando 7-amino-actinomicina D (7-AAD) (Molecular Probes, Eugene, OR). Uma amostra para ensaios clonogênicos de Hill e EBM2 é retirada do sangue periférico do paciente antes e depois da mobilização (no momento da coleta de LKF).

Procedimento de implante. Após anestesia locorregional e desinfecção cutânea abaixo do joelho, 45-48 ml de suspensão de solução salina autóloga CD133+ são administrados por via intramuscular com injeção profunda de 1 ml através de agulha 18G. As injeções foram alocadas da seguinte forma: 10 ml no compartimento anterior da perna, 10 ml no compartimento posterior superficial, 10 ml no compartimento posterior profundo, 10 ml no compartimento lateral e o restante no pé.

Avaliação e acompanhamento de linha de base. A avaliação da dor é realizada com uma escala pessoal de 3 graus (leve, moderada e intensa) e o monitoramento do uso de analgésicos. As lesões isquêmicas são tratadas semanalmente por uma enfermeira especializada em tratamento de feridas. No pré-operatório e aos 3, 6 e 12 meses após o implante são avaliados CEUS, evolução da lesão e controle da dor.