Autologe endoteliale stamceller (EPC) fra perifert blod ved behandling av kritisk ekstremitetsiskemi

Type studie. Prospektivt enkeltsenter ikke randomisert. Målet med studiet. For å vurdere sikkerheten, gjennomførbarheten og effekten av lokal intramuskulær administrering av autologe utvalgte CD 133+-celler hos pasienter som lider av CLI.

Alle pasientene som ble registrert led av CLI i henhold til TASC 2-definisjonene og hadde ingen revaskulariseringsmulighet, på grunnlag av kontrast-CT eller angiografiavbildning. Et detaljert informert samtykke, godkjent av vårt EC, hadde vært nødvendig. En alder lavere enn 18 år og over 70 år på grunn av dårlig margreaksjon på legemiddelsimulering hos eldre mennesker. Klinisk ustabilitet i CLI, som koldbrann som krever større amputasjon og dårlig forventet levealder, ble introdusert som eksklusjonskriterier for antatt latens av EPCs handling. Alvorlig systemisk sykdom ble vurdert å øke risikoen for margstimulering. Pasienter med allergisk diatese, fertil alder, tidligere EPC-muskulært implantat, tidligere medisinsk eksperimentell protokoll og enhver interessekonflikt med studien ble ekskludert.

Pasienter: vi registrerer pasienter med en historie med Rutherford stadium 4 (hvilesmerter) eller 5 (små iskemiske lesjoner) PAD. Alle pasientene har tidligere (kontrast-CT, MR eller angiografi) vaskulær avbildning ekskludert revaskulariseringsalternativer, både endovaskulær og åpne og møtte innrullerings- og eksklusjonskriteriene. Hver pasient gjennomgår rutinemessig fysisk og instrumentell undersøkelse inkludert elektrokardiogram, røntgen av thorax og blodprøveanalyse. Yngre pasienter oppfylte Buergers sykdomskriterier, mens andre hadde rene aterosklerotiske lesjoner.

CEUS Imaging Protocol. To operatører (F.C. og A.G., med henholdsvis 20 og 3 års erfaring) som er blindet for behandling, utfører kontrastforsterket UL for alle pasienter. To amerikanske skannere (Philips iU22 (Bothell, WA, USA) med lineær array L9-3 transduser og GE Logiq e9 (GE Healthcare, Milwaukee, WI, USA) med lineær array L6-9 transduser brukes.

Bildeparameterne er: redusert sendeeffekt (mekanisk indeks <0,06), med omtrent 7-10 bilder per sekund og ett fokus godt under nivået til målet for å sikre et mer jevnt trykkfelt. Dual-mode presentasjon av et gråtonebilde side ved side med kontrastbildet forenklet sanntidsidentifikasjon av anatomiske strukturer og ROI-valg. Bildeløkker på omtrent 60 sekunder ble oppnådd. Det ble forsøkt å ha en jevn forsterkning på tvers av bildet og for å unngå forsterkningsmetning. TGC (tidsforsterkningskompensasjon) ble satt slik at før kontrastankomst ble det vist et ensartet svart bilde. Et hetteglass med kontrastmiddel (SonoVue BR1; Bracco, Milano, Italia) tilberedes med en konsentrasjon på ca. 2x108 svovelheksafluoridfylte mikrobobler per milliliter, i henhold til produsentens anbefalinger. Før hver injeksjon resuspenderes mikrobobler ved å riste hetteglasset. Posisjonen til sonden registreres for hver pasient for å opprettholde samme posisjon under oppfølgingen. Kontrastinjeksjonen består av en intravenøs bolus på 4,8 ml kontrastmiddel injisert i antecubital vene på 2 sekunder etterfulgt av en saltvannsskylling på 5 ml. Injeksjonen gjøres med pasienten liggende og etter 10 minutters hvile for å unngå treningsrelatert mikrovaskulær dilatasjon. Radiologen opprettholder et konstant bildeplan ved hjelp av vevet (grunnbildet) i "Kontrast Side/Side" avbildningsmodus.

Bildeanalyse. Bildeløkkene overføres til en personlig datamaskin for videre analyse. De viktigste bildeanalyseoppgavene er: a) identifikasjon av tibialis anterior arterie (TAA) område, b) valg av en representativ region av normal tibialis anterior muskel (TAM) og c) formulering av tidsintensitetskurver. To manuelt definerte regioner av interesse (ROI), 2 cm og 4 cm side-firkanter, plasseres henholdsvis over tibialis anterior muskel uten tegn på arterielle grener, over tibialis anterior arterie og over en liten tibialis arteriell gren. ROI-ene plasseres i samme anatomiske posisjon for hver pasient for å unngå uønskede forskjeller under oppfølgingsundersøkelser. En tid/intensitetskurve (TIC) oppnås for hver ROI. Fra en analyse av CEUS-tidsintensitetskurver beregner vi regional blodstrøm (RBF) og volum (RBV). Tidsintensitetskurver trekkes ut ved hjelp av kommersiell kvantifiseringsprogramvare (QontraXt v.3.60, AMID, Roma, Italia). Denne programvaren tillater manuell valg av interesseområde (ROI), måling av det valgte ROI-området og gir lineære data for tidsintensitetskurvene. For ROI i normal ATM arbeides det med å plassere regionen i et område uten store fartøyer. Avkastningen til ATA er et kvadratisk område på 2 cm og ATM-avkastningen er et kvadratisk område på 4 cm. Tidsintensitetskurver oppnås ved å beregne gjennomsnittsintensiteten til piksler som er omfattet av ROI på hvert tidspunkt. For hver bildeløkke beregnes:

• RBV som består av den totale mengden kontrastmidler innenfor valgt ROI, i en periode. På grunn av egenskapene til amerikanske kontrastmidler, reflekterer det mengden blod i et definert område. Det er direkte relatert til arealet under kurven (AUC).
• RBF som er i direkte forhold til perfusjon i en gitt ROI. Den består av kontrastmediestrømmen (relatert til blodstrømmen) i en valgt ROI. Det er relatert til den gjennomsnittlige transitttiden.

Margstimulering. Human rekombinant granulocyttkolonistimulerende faktor (rhGCSF) administreres subkutant i 4-5 påfølgende dager i en dose på 10 µg/kg daglig, delt i 2 doser. Fra og med tredje dag av mobilisering overvåkes CD133+-celletallet daglig ved cytofluorimetrisk analyse på en 2 ml prøve hentet fra pasientens perifere blod. Minimum CD133+ celletall akseptabelt for leukaferese (LKF) samling var 10/µl. Pasienter overvåkes for eventuelle G-CSF-relaterte bivirkninger.

Leukaferese samling. En enkelt LKF-innsamling er planlagt for hver pasient som bruker en tredjegenerasjons celleseparatorenhet (Spectra Cobe, Lakewood, CO), som behandler minst 2,5 blodvolumer i henhold til vår interne protokoll for stamcelleinnsamling. Pasientene overvåkes for blodtrykk og hjertefrekvens under hele innsamlingsprosedyren. Umiddelbart etter LKF tas en prøve fra pasientens perifere blod for hemocytometrisk analyse for å evaluere antall blodplater og Hb-nivåer. Hver leukaferesesamling fortynnes med 10 % syresitrat dekstrose (ACD-A) og holdes over natten ved 4 °C før immunomagnetisk cellevalg. En prøve på 2 ml fra hver LKF-pose tas for cytofluorimetrisk analyse. Fire timer etter LKF-samlingen blir koagulasjonsparametere, elektrolyttnivåer og hemocytometrisk analyse evaluert.

Immunomagnetisk cellevalg. CD133 immunomagnetiske cellevalg utføres dagen etter LKF-innsamling ved bruk av Clini-MACS (Miltenyi Biotec)-enheten i henhold til produsentens standardprotokoll. Kort fortalt tilsettes CliniMACS CD133-reagens (dannet av superparamagnetiske partikler sammensatt av jernoksid og dekstran konjugert til murine monoklonale antistoffer) til cellene for inkubering. Produktet vaskes deretter ved fortynning med buffer (CliniMACS PBS-EDTA-buffer supplert med 0,5 % humant serumalbumin) og celleposen henges på enheten for automatisert utvalg av CD133-merkede celler. En prøve på 2 ml fra den positive fraksjonen tas for cytofluorimetrisk analyse.

Kvalitetskontroller. Klonogene analyser. En prøve tatt fra den CD133-cellepositive fraksjonen etter hver immunomagnetisk celleseleksjonsprosedyre blir sådd for kortsiktige (14 dager) klonogene analyser. En standard blanding av metylcellulose pluss rekombinant humant erytropoietin, rh stamcellefaktor (SCF), rhGM-CSF og rh interleukin-3 (IL-3) brukes (Stem Cell Technologies, Vancouver, BC, Canada; MACS Media, Miltenyi Biotec GmbH, Bergisch Gladbach, Tyskland). Mikrobielle kulturer. Mikrobielle kulturer på immunseleksjonsavfallsposen som inneholder den negative fraksjonen utføres for å påvise aerobe-anaerobe bakterier og soppforurensning. En prøve på 10 ml inokuleres i kulturmediet (Bact/Alert FA og BacT/Alert FN, Organon Teknika Corp., Durham, NC) og inkuberes i 10 dager ved 37°C.

Cytofluorimetrisk analyse. Prøver hentet fra perifert blod før mobilisering med G-CSF, ved leukaferese og etter immunomagnetisk celleseleksjon blir analysert ved flowcytometri for å evaluere ekspresjonen av spesifikke stamcelle- og endotelantigener. Becton Dickinson FACSCanto ble brukt for alle flowcytometriske analyser med en lyse no-wash-teknikk, ved bruk av følgende monoklonale antistoffer: anti-CD45 fluorescein isothiocyanat (FITC) (Becton Dickinson, San Jose, CA), anti-CD34 Peridinin-klorofyll-protein kompleks (PerCP) (8G12-klon, Becton Dickinson), anti-CD133-fykoerytrin (PE) (AC133-klon, Miltenyi Biotec) og anti-VEGF-R2 allofykocyanin (APC) (FoU-systemer). Fullblod behandles etter instruksjonene for VEGF-R2 (KDR) bestemmelse. Hver blodprøve overføres til et 50 ml falkrør og bringes til et totalt volum på 30 ml ved å tilsette ammoniumfosfatholdig lyseringsbuffer (Becton Dickinson). Etter en lyseringsperiode på 5 minutter sentrifugeres PB ved 500 g i 5 minutter og vaskes to ganger med PBS som inneholder 0,5 % bovint serumalbumin (BSA). 100 µl av hver prøve overføres deretter til et BD-rør for cytometrisk analyse og inkuberes i 15 minutter med 1 µg/105 celler IgG for å blokkere alle uspesifikke steder. 50 µl av den IgG-blokkerte prøven inkuberes med 20 µl anti-VEGF-R2-antistoff i 30 minutter ved 4°C i mørket og vaskes deretter to ganger med PBS. På slutten av det siste vasketrinnet tilsettes 10 ul av hvert av de andre antistoffene (anti-CD45, anti-CD34, anti-CD133) og inkuberes i 10 minutter ved romtemperatur i mørket. Hver prøve er innhentet med BD FACSCanto som registrerer 100.000 hendelser inne i lymfocytten pluss monocyttporten. Datafiler analyseres med FACS Diva 6.1 programvare. Levedyktighet vurderes ved å bruke 7-amino-actinomycin D (7-AAD) (Molecular Probes, Eugene, OR). En prøve for Hill og EBM2 klonogene analyser tas fra pasientens perifere blod før og etter mobilisering (på tidspunktet for LKF-samling).

Implantatprosedyre. Etter lokoregional anestesi og under kneet kutan desinfeksjon, administreres 45-48 ml autolog CD133+ saltvannsoppløsning intramuskulært med 1 ml dyp injeksjon gjennom 18G nål. Injeksjonene ble fordelt slik: 10 ml i fremre del av benet, 10 ml i overfladisk bakre del, 10 ml i dyp bakre del, 10 ml i siderom og den resterende del i foten.

Grunnlagsvurdering og oppfølging. Smertevurdering utføres med en personlig skala på 3 grader (mild, moderat og alvorlig) og de smertestillende medikamentene bruker overvåking. Iskemiske lesjoner behandles ukentlig av en dyktig sykepleier. Preoperativt og 3, 6 og 12 måneder etter implantatet vurderes CEUS, lesjonsutvikling og smertebehandling.