Células progenitoras endoteliales autólogas (EPC) de sangre periférica en el tratamiento de la isquemia crítica de las extremidades

Tipo de estudio. Centro único prospectivo no aleatorizado. Objetivo del estudio. Evaluar la seguridad, la viabilidad y la eficacia de la administración intramuscular local de células CD 133+ autólogas seleccionadas en pacientes que padecen ICE.

Todos los pacientes inscritos sufrían CLI de acuerdo con las definiciones de TASC 2 y no tenían opción de revascularización, sobre la base de imágenes de angiografía o TC de contraste. Se había requerido un consentimiento informado detallado, aprobado por nuestro CE. Una edad menor de 18 años y mayor de 70 años debido a una mala respuesta de la médula a la simulación de drogas en personas mayores. La inestabilidad clínica del ICE, como la gangrena que requiere una amputación mayor y la baja expectativa de vida, se introdujeron como criterios de exclusión por supuesta latencia del acción de los EPC. Se consideró que la enfermedad sistémica grave aumentaba el riesgo de la estimulación de la médula. Se excluyeron pacientes con diátesis alérgica, edad fértil, implante muscular EPC previo, protocolo médico experimental previo y cualquier conflicto de interés con el estudio.

Pacientes: inscribimos pacientes con antecedentes de EAP en estadio 4 (dolor en reposo) o 5 (lesiones isquémicas pequeñas) de Rutherford. Todos los pacientes tenían imágenes vasculares previas (TC de contraste, RM o angiografía) excluyendo las opciones de revascularización, tanto endovascular como abierta y cumplieron con los criterios de inclusión y exclusión. Todos los pacientes se someten a un examen físico e instrumental de rutina que incluye electrocardiograma, radiografía de tórax y análisis de muestras de sangre. Los pacientes más jóvenes cumplían los criterios de la enfermedad de Buerger, mientras que otros tenían lesiones ateroscleróticas puras.

Protocolo de imágenes CEUS. Dos operadores (F.C. y A.G., con 20 y 3 años de experiencia, respectivamente) que desconocen el tratamiento realizan ecografías con contraste para todos los pacientes. Se utilizan dos escáneres estadounidenses (Philips iU22 (Bothell, WA, EE. UU.) con transductor de matriz lineal L9-3 y GE Logiq e9 (GE Healthcare, Milwaukee, WI, EE. UU.) con transductor de matriz lineal L6-9.

Los parámetros de imagen son: potencia de transmisión reducida (índice mecánico <0.06), a aproximadamente 7-10 fotogramas por segundo y un foco muy por debajo del nivel del objetivo para garantizar un campo de presión más uniforme. La presentación en modo dual de una imagen en escala de grises junto a la imagen de contraste facilitó la identificación en tiempo real de estructuras anatómicas y la selección de ROI. Se adquirieron bucles de imagen de aproximadamente 60 segundos. Se hizo un esfuerzo para tener una ganancia uniforme en toda la imagen y evitar la saturación de la ganancia. El TGC (compensación de ganancia de tiempo) se configuró de manera que antes de la llegada del contraste se mostrara una imagen negra uniforme. Se prepara un vial de agente de contraste (SonoVue BR1; Bracco, Milán, Italia) a una concentración de alrededor de 2x108 microburbujas llenas de hexafluoruro de azufre por mililitro, de acuerdo con las recomendaciones del fabricante. Antes de cada inyección, las microburbujas se resuspenden agitando el vial. La posición de la sonda se registra para cada paciente con el fin de mantener la misma posición durante el seguimiento. La inyección de contraste consiste en un bolo intravenoso de 4,8 ml de agente de contraste inyectado en la vena antecubital en 2 segundos, seguido de un lavado con solución salina de 5 ml. La inyección se realiza con el paciente en decúbito supino y después de 10 minutos de reposo para evitar la dilatación microvascular relacionada con el ejercicio. El radiólogo mantiene un plano de imagen constante con la ayuda del tejido (imagen fundamental) del modo de imagen "Contrast Side/Side".

Análisis de imagen. Los bucles de imágenes se transfieren a una computadora personal para su posterior análisis. Las principales tareas de análisis de imágenes son: a) identificación del área de la arteria tibial anterior (TAA), b) selección de una región representativa del músculo tibial anterior normal (TAM) y c) formulación de curvas de tiempo-intensidad. Se colocan dos regiones de interés (ROI) definidas manualmente, cuadrados de 2 cm y 4 cm de lado, respectivamente, sobre el músculo tibial anterior sin evidencia de ramas arteriales, sobre la arteria tibial anterior y sobre una pequeña rama arterial tibial. Las ROI se colocan en la misma posición anatómica para cada paciente para evitar diferencias no deseadas durante los exámenes de seguimiento. Se obtiene una curva de tiempo/intensidad (TIC) para cada ROI. A partir de un análisis de las curvas de intensidad de tiempo de CEUS, calculamos el flujo sanguíneo regional (RBF) y el volumen (RBV). Las curvas de tiempo-intensidad se extraen utilizando un software de cuantificación comercial (QontraXt v.3.60, AMID, Roma, Italia). Este software permite la selección manual de la región de interés (ROI), la medición del área de ROI seleccionada y proporciona datos lineales para las curvas de tiempo-intensidad. Para el ROI en la ATM normal se hace un esfuerzo por situar la región en una zona sin grandes buques. El ROI del ATA es un área cuadrada de 2 cm y el ROI del cajero automático es un área cuadrada de 4 cm. Las curvas de intensidad de tiempo se obtienen calculando la intensidad media de los píxeles incluidos en el ROI en cada punto de tiempo. Para cada bucle de imagen se calculan:

• RBV que consiste en la cantidad total de medios de contraste dentro del ROI seleccionado, en un período de tiempo. Debido a las características de los medios de contraste de EE. UU., refleja la cantidad de sangre en una región definida. Está directamente relacionado con el área bajo la curva (AUC).
• RBF que está en proporción directa a la perfusión en un ROI dado. Consiste en el flujo de medios de contraste (relacionado con el flujo de sangre) en un ROI seleccionado. Está relacionado con el Tiempo Medio de Tránsito.

Estimulación de la médula. El factor estimulante de colonias de granulocitos recombinantes humanos (rhGCSF) se administra por vía subcutánea durante 4-5 días consecutivos a una dosis de 10 µg/kg al día, dividida en 2 dosis. A partir del tercer día de movilización, el recuento de células CD133+ se controla diariamente mediante análisis citofluorimétrico en una muestra de 2 ml obtenida de sangre periférica de los pacientes. El recuento mínimo de células CD133+ aceptable para la recolección de leucoféresis (LKF) fue de 10/µl. Los pacientes son monitoreados por cualquier efecto secundario relacionado con G-CSF.

Colección de leucoféresis. Se planifica una sola recolección de LKF para cada paciente utilizando un dispositivo separador de células de tercera generación (Spectra Cobe, Lakewood, CO), que procesa al menos 2,5 volúmenes de sangre de acuerdo con nuestro protocolo interno para la recolección de células madre. Los pacientes son monitoreados para la presión arterial y la frecuencia cardíaca durante todo el procedimiento de recolección. Inmediatamente después de la LKF, se toma una muestra de sangre periférica del paciente para un análisis hemocitométrico para evaluar el recuento de plaquetas y los niveles de Hb. Cada colección de leucaféresis se diluye con dextrosa citrato ácido al 10 % (ACD-A) y se mantiene durante la noche a 4 °C antes de la selección de células inmunomagnéticas. Se toma una muestra de 2 ml de cada bolsa LKF para análisis citofluorimétrico. Cuatro horas después de la recolección de LKF, se evalúan los parámetros de coagulación, los niveles de electrolitos y el análisis hemocitométrico.

Selección de células inmunomagnéticas. Las selecciones de células inmunomagnéticas CD133 se realizan el día después de la recogida de LKF utilizando el dispositivo Clini-MACS (Miltenyi Biotec) según el protocolo estándar del fabricante. Brevemente, el reactivo CliniMACS CD133 (formado por partículas súper paramagnéticas compuestas de óxido de hierro y dextrano conjugado con anticuerpos monoclonales murinos) se agrega a las células para su incubación. Posteriormente, el producto se lava por dilución con tampón (tampón CliniMACS PBS-EDTA suplementado con albúmina de suero humano al 0,5 %) y la bolsa de células se cuelga en el dispositivo para la selección automática de células marcadas con CD133. Se toma una muestra de 2 ml de la fracción positiva para análisis citofluorimétrico.

Controles de calidad. Ensayos clonogénicos. Una muestra tomada de la fracción positiva de células CD133 después de cada procedimiento de selección de células inmunomagnéticas se siembra para ensayos clonogénicos a corto plazo (14 días). Se emplea una mezcla estándar de metilcelulosa más eritropoyetina humana recombinante, factor de células madre rh (SCF), rhGM-CSF e interleucina-3 rh (IL-3) (Stem Cell Technologies, Vancouver, BC, Canadá; MACS Media, Miltenyi Biotec GmbH, Bergisch Gladbach, Alemania). Cultivos microbianos. Se realizan cultivos microbianos en la bolsa de residuos de inmunoselección que contiene la fracción negativa para detectar bacterias aeróbicas-anaeróbicas y contaminación fúngica. Se inocula una muestra de 10ml en el medio de cultivo (Bact/Alert FA y BacT/Alert FN, Organon Teknika Corp., Durham, NC) y se incuba durante 10 días a 37°C.

Análisis citofluorimétrico. Las muestras obtenidas de sangre periférica antes de la movilización con G-CSF, en el momento de la leucaféresis y después de la selección de células inmunomagnéticas se analizan mediante citometría de flujo para evaluar la expresión de células madre específicas y antígenos endoteliales. Se empleó Becton Dickinson FACSCanto para todos los ensayos de citometría de flujo con una técnica de lisado sin lavado, utilizando los siguientes anticuerpos monoclonales: anti-CD45 isotiocianato de fluoresceína (FITC) (Becton Dickinson, San José, CA), anti-CD34 Peridinin-clorofila-proteína (PerCP) (clon 8G12, Becton Dickinson), ficoeritrina (PE) anti-CD133 (clon AC133, Miltenyi Biotec) y aloficocianina anti-VEGF-R2 (APC) (R&D systems). La sangre completa se procesa siguiendo las instrucciones para la determinación de VEGF-R2 (KDR). Cada muestra de sangre se transfiere a un tubo falcon de 50 ml y se lleva a un volumen total de 30 ml añadiendo tampón de lisis que contiene fosfato de amonio (Becton Dickinson). Después de un período de lisis de 5 minutos, el PB se centrifuga a 500 g durante 5 minutos y se lava dos veces con PBS que contiene un 0,5 % de albúmina de suero bovino (BSA). A continuación, se transfieren 100 µl de cada muestra a un tubo BD para análisis citométrico y se incuban durante 15 minutos con 1 µg/105 células IgG para bloquear todos los sitios no específicos. Se incuban 50 µl de la muestra bloqueada con IgG con 20 µl de anticuerpo anti-VEGF-R2 durante 30 minutos a 4°C en la oscuridad y luego se lavan dos veces con PBS. Al final del último paso de lavado, se añaden 10 µl de cada uno de los otros anticuerpos (anti-CD45, anti-CD34, anti-CD133) y se incuban 10 minutos a temperatura ambiente en la oscuridad. Cada muestra se adquiere con BD FACSCanto grabando 100.000 eventos dentro de la puerta de linfocitos más monocitos. Los archivos de datos se analizan con el software FACS Diva 6.1. La viabilidad se evalúa utilizando 7-amino-actinomicina D (7-AAD) (Molecular Probes, Eugene, OR). Se toma una muestra para los ensayos clonogénicos Hill y EBM2 de la sangre periférica del paciente antes y después de la movilización (en el momento de la recolección de LKF).

Procedimiento de implante. Después de la anestesia locorregional y la desinfección cutánea debajo de la rodilla, se administran 45-48 ml de suspensión de solución salina autóloga CD133+ por vía intramuscular con inyección profunda de 1 ml a través de una aguja 18G. Las inyecciones se distribuyeron así: 10 ml en el compartimento anterior de la pierna, 10 ml en el compartimento posterior superficial, 10 ml en el compartimento posterior profundo, 10 ml en el compartimento lateral y el resto en el pie.

Evaluación inicial y seguimiento. La valoración del dolor se realiza con una escala personal de 3 grados (leve, moderado y severo) y el seguimiento del uso de analgésicos. Las lesiones isquémicas son tratadas semanalmente por una enfermera especializada en el manejo de heridas. Preoperatorio ya los 3, 6 y 12 meses del implante se valoran CEUS, evolución de la lesión y manejo del dolor.